任曉俠，方 瑩，楊洪彬

(西安市兒童醫(yī)院，陜西 西安 710003)

TNF-α在小兒結(jié)腸息肉中的表達(dá)及臨床意義

任曉俠，方 瑩，楊洪彬

(西安市兒童醫(yī)院，陜西 西安 710003)

目的 探討內(nèi)源性腫瘤壞死因子α(TNF-α)在小兒結(jié)腸息肉中的表達(dá)及臨床意義。方法 采集45例結(jié)腸息肉患兒(實(shí)驗(yàn)組)及36例正常結(jié)腸粘膜兒童(對(duì)照組)的血清，運(yùn)用夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法檢測(cè)TNF-α在兩組血清中的表達(dá)；免疫組化法檢測(cè)TNF-α在兩組患兒結(jié)腸組織中的表達(dá)，分析TNF-α的表達(dá)與結(jié)腸息肉的關(guān)系。結(jié)果 TNF-α在實(shí)驗(yàn)組血清中的表達(dá)高于對(duì)照組(t=5.360，P<0.05)，在實(shí)驗(yàn)組結(jié)腸組織中表達(dá)高于對(duì)照組(χ2=10.434，P<0.05)；在實(shí)驗(yàn)組中，腺瘤性息肉中TNF-α的表達(dá)較幼年性息肉中無明顯差異(P>0.05)。結(jié)論 TNF-α在結(jié)腸息肉組織中的高表達(dá)，提示TNF-α在兒童結(jié)腸息肉的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用，有可能成為判斷結(jié)腸息肉預(yù)后復(fù)發(fā)的標(biāo)志物。

腫瘤壞死因子α；兒童；結(jié)腸息肉；病理診斷；夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法；免疫組化

結(jié)腸息肉是兒童消化系統(tǒng)常見疾病。大多數(shù)為單發(fā)、且為良性病變，病理分為幼年性、腺瘤性、炎癥性和增生性等四種，其中90%為幼年性息肉，常見于2～10歲的兒童，由炎癥引發(fā)的幾率較大。在患病兒童中，一般以6歲左右較為常見[1]。結(jié)腸息肉最常見的癥狀為間歇性無痛性便血，占80%～100%，隨著全結(jié)腸鏡檢查技術(shù)的普及應(yīng)用，結(jié)腸息肉的檢出率逐漸升高。結(jié)腸息肉也是兒童最常見良性腫瘤之一[2]。患兒若得不到有效治療，免疫力會(huì)顯著降低，同時(shí)并發(fā)因慢性失血所致的缺鐵性貧血和營(yíng)養(yǎng)不良等癥狀，長(zhǎng)期以往會(huì)影響患兒生長(zhǎng)發(fā)育，甚至可引起腸套疊等外科急腹癥。但結(jié)腸息肉的病因及發(fā)病機(jī)制至今仍不清楚[3]，其中結(jié)腸粘膜長(zhǎng)期的炎癥刺激是公認(rèn)的病因之一。腫瘤壞死因子α(TNF-α)是機(jī)體內(nèi)的一種生物活性因子，由肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，活性強(qiáng)，在機(jī)體炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本研究通過測(cè)定TNF-α在結(jié)腸息肉患兒血清及組織中的表達(dá)水平，探討其在小兒結(jié)腸息肉發(fā)病機(jī)制中的作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集西安市兒童醫(yī)院2010年5月至2012年12月在消化科行結(jié)腸鏡檢查的221例有消化道癥狀的患兒。從中篩選出45例確診為結(jié)腸息肉的患兒納入研究(實(shí)驗(yàn)組)，其中男28例，女17例，年齡3～12歲。男女比例1.64:1，平均年齡6.24±2.8歲，年齡10歲以上8例。其中因反復(fù)無痛性便血就診而行結(jié)腸鏡檢查確診息肉的有42例，便血病程1～12月，平均病程6.4±3.1個(gè)月，多表現(xiàn)為間斷出現(xiàn)的成形大便表面帶鮮血或者便后滴鮮血；另有3例以腸套疊收住普外科，入院后行空氣灌腸后腸套疊復(fù)位成功，出院后短時(shí)間再次腸套疊，再次空氣灌腸灌通后行結(jié)腸鏡檢查，鏡下診斷結(jié)腸息肉，3例患兒息肉位置均較深，于右半結(jié)腸處，長(zhǎng)粗蒂，直徑均在2.5～3cm之間；45例患兒結(jié)腸息肉直徑大小在0.8cm～3.0cm之間。無蒂息肉16例，亞蒂息肉20例，粗蒂9例。單發(fā)結(jié)腸息肉37例，2個(gè)或2個(gè)以上結(jié)腸息肉8例。45例結(jié)腸息肉患兒均行電子結(jié)腸鏡下電凝切除術(shù)。術(shù)后隨訪僅1例復(fù)發(fā)者，為結(jié)腸多發(fā)息肉患兒。將結(jié)腸鏡檢查為正常結(jié)直腸粘膜的兒童36例納入對(duì)照組(排除合并炎癥性腸病等其他疾病，且資料不完整者)。兩組患兒性別、年齡等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性，兩組患者及家長(zhǎng)知情，行結(jié)腸鏡檢查前均簽署了知情同意書。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

采用Olympus Q260AI電子結(jié)腸鏡行全結(jié)腸檢查，發(fā)現(xiàn)息肉，根據(jù)其大小、數(shù)量及蒂的長(zhǎng)短，靜脈復(fù)合麻醉下經(jīng)ERBE電刀高頻電凝電切摘除結(jié)腸息肉治療，根據(jù)其息肉的病理進(jìn)行診斷。

1.3 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

入組患者符合小兒結(jié)腸息肉的診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡3～12歲之間，臨床資料完整，能夠較好的配合實(shí)驗(yàn)。排除有腸道腫瘤、先天腸管畸形患者，排除心、腎功能不全患者，排除哭鬧較嚴(yán)重、不能配合實(shí)驗(yàn)患者。

1.4 方法

1.4.1 血清及病理組織的采集

兩組患兒入院后，采集空腹清晨血，存血容器需保證無熱原且無內(nèi)毒素，全程不干擾細(xì)胞活性。采血完畢后，以3 000r/min進(jìn)行離心處理，持續(xù)10min，分離血清和紅細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)組患者結(jié)腸息肉予以結(jié)腸鏡電凝切除處理，將結(jié)腸息肉標(biāo)本于10%福爾馬林液中儲(chǔ)存并石蠟包埋。對(duì)照組患兒在進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查后，乙狀結(jié)腸至直腸位置取活檢于10%福爾馬林液中儲(chǔ)存并石蠟包埋，備用。

1.4.2 腫瘤壞死因子α的測(cè)定

1.4.2.1 運(yùn)用夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法檢測(cè)腫瘤壞死因子α在血清中的表達(dá) 進(jìn)行雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，在TNF-α抗體內(nèi)，分別添加標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗體，用于檢測(cè)，溫育處理后清洗干凈，并選取四甲基聯(lián)苯胺(TMB)進(jìn)行顯色，顯色過程中，由于有過氧化物酶的參與，由藍(lán)色轉(zhuǎn)換為黃色。實(shí)驗(yàn)中顏色與TNF-α有直接關(guān)聯(lián)。波長(zhǎng)控制在450nm內(nèi)，選取酶標(biāo)儀吸光度(OD值)進(jìn)行檢測(cè)，得出樣品濃度。繪制Excel工作表，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，縱坐標(biāo)為其OD值，在曲線圖像中，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。

1.4.2.2 免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)組織中腫瘤壞死因子α的表達(dá)濃度 選擇美國ZYMED公司SP系列：抗人TNF-αbs-0078R為一抗，二抗為山羊抗兔IgG SP-0023，具體步驟：石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。蒸餾水沖洗，磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡5min；3%H2O2去離子水孵育15min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，370C孵育2～3h或40℃過夜，PBS沖洗，3min×3次，滴加二抗工作液，370C孵育10～15min；PBS沖洗，3min×3次；加入辣根酶對(duì)鏈酶卵白素工作液進(jìn)行標(biāo)記處理并賦予15min，保持環(huán)境溫度以37℃為宜；PBS沖洗，3min×3次；顯色劑顯色，自來水沖洗，復(fù)染、脫水、透明，最后進(jìn)行封片。對(duì)照試驗(yàn)：陰性對(duì)照選取PBS。

結(jié)果判斷：TNF-α陽性細(xì)胞：主要為胞漿著色，呈淺黃色、細(xì)顆粒狀，陰性對(duì)照均無陽性著色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 病理類型分布

45例息肉患兒經(jīng)電子結(jié)腸鏡下行電凝切除術(shù)，切下息肉標(biāo)本通過病理診斷發(fā)現(xiàn)，其中41例為幼年性息肉，4例為腺瘤性息肉。幼年性息肉病理特點(diǎn)：息肉為擴(kuò)張的充滿黏液的彎曲的囊腺和在突起的固有層中的炎性細(xì)胞，腺體含有分化良好的黏液細(xì)胞，間質(zhì)明顯增寬，內(nèi)有豐富的結(jié)締組織，其中含大量的血管和炎性細(xì)胞。腺瘤性息肉病理特點(diǎn)：腫物由增生的腺體和纖維組織構(gòu)成，局部腺體排列密集，見圖1。

a.正常結(jié)腸粘膜(10×20) b.腺瘤性息肉(10×20) c.幼年性息肉(10×20)

a. Normal colonic mucosa(10×20) b. Adenomatous polyp(10×20) c. Juvenile polyp(10×20)

圖1 兩組結(jié)腸粘膜的病理結(jié)果

Fig.1 Pathological results of colon mucosa of two groups

2.2 兩組患者血清中腫瘤壞死因子α水平的比較

ELISA法顯示：與正常粘膜組比較，實(shí)驗(yàn)組患者血清中TNF-α水平較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.3 腫瘤壞死因子α在兩組結(jié)腸組織中的表達(dá)

應(yīng)用免疫組織化學(xué)分析TNF-α在對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)，表達(dá)過程多由細(xì)胞漿參與。如圖2所示，對(duì)照組的樣本中，TNF-α染色的組織部分較少，且呈淺黃色，說明對(duì)照組TNF-α表達(dá)較低。而實(shí)驗(yàn)樣本的結(jié)腸息肉組織中，可觀察到較多的淺黃色組織顆粒，說明TNF-α在實(shí)驗(yàn)組織中表達(dá)較高，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中在實(shí)驗(yàn)組中腺瘤性息肉TNF-α的表達(dá)較幼年性息肉無明顯差異，P>0.05，見表2。

a.正常結(jié)腸粘膜(10×20) b.腺瘤性息肉(10×20) c.幼年性息肉(10×20)

a. Normal colonic mucosa(10×20) b. Adenomatous polyp(10×20) c. Juvenile polyp(10×20)

圖2 兩組結(jié)腸組織中TNF-α的表達(dá)

Fig.2 Expression of TNF-α in colonic tissue of two groups

表2 兩組患者TNF-α陽性率比較[n(%)]

Table 2 Comparison of TNF-α positive rate between two groups[n(%)]

2.4 在結(jié)腸組織中腫瘤壞死因子α的表達(dá)與臨床病理特征

在45例結(jié)腸息肉患兒的實(shí)驗(yàn)組織中，TNF-α的表達(dá)陽性率與患兒性別、年齡、息肉部位、息肉大小、病理類型均無明顯關(guān)系(均P>0.05)，但其在多發(fā)實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)陽性率高于單發(fā)實(shí)驗(yàn)組中的陽性率，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。其中1例復(fù)發(fā)患兒為多發(fā)結(jié)腸息肉，其粘膜組織中TNF-α的表達(dá)為陽性，因復(fù)發(fā)組樣本數(shù)目較少，故無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

表3 結(jié)腸息肉組織中TNF-α的表達(dá)與臨床病理特征[n(%)]

Table 3 TNF-α expression and clinicopathological features in colonic polyps[n(%)]

3 討論

3.1 腫瘤壞死因子α在腫瘤組織及炎癥性疾病中的作用

TNF-α是一種由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，是重要的促炎因子和免疫調(diào)節(jié)因子，在腫瘤組織及炎癥性疾病均發(fā)揮重要作用。在腫瘤惡變過程中，機(jī)體的巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞等的浸潤(rùn)情況較為明顯。在炎癥發(fā)生的最初，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生TNF-α，與機(jī)體血管與組織的修復(fù)以及腫瘤的生長(zhǎng)等方面均有密切聯(lián)系。研究證實(shí)，予以小鼠TNF-α拮抗劑，觀察其結(jié)腸腺瘤性息肉與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)換情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的數(shù)量明顯減少[4]。TNF-α可以激活機(jī)體的激活劑蛋白-1(AP-1)和轉(zhuǎn)錄因子NF-KB途徑，并以該兩種方式使細(xì)胞加速繁殖，使腫瘤病情加快發(fā)展。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，肝癌動(dòng)物模型在MdrZ缺失的情況下，TNF-α可以通過激活NF-KB的方式影響病情[5]，腸道腫瘤方面，作用方式尚不清楚。在對(duì)結(jié)腸癌的動(dòng)物進(jìn)行探究時(shí)發(fā)現(xiàn)，與上皮細(xì)胞相比，TNF-α受體在造血細(xì)胞的表達(dá)更強(qiáng)[6]。兒童結(jié)腸息肉大部分為良性病變，但仍存在惡變潛能。多發(fā)性息肉如幼年性息肉病則有癌變傾向，腺瘤性息肉與癌關(guān)系密切，其癌變發(fā)生率隨著瘤體的增大而增高；病理發(fā)現(xiàn)，有些患兒癥狀表現(xiàn)為幼年性息肉與腺瘤性息肉共同特征，惡化幾率明顯增加[7]。其他如家族性息肉病(familial adenomatous polyposis，F(xiàn)AP)及Peutz-Jeghers綜合征(PJS)也屬癌前病變。本研究中免疫組織化學(xué)分析TNF-α在正常粘膜組結(jié)腸粘膜及實(shí)驗(yàn)組結(jié)腸息肉中的表達(dá)，TNF-α在以上組織中以細(xì)胞漿表達(dá)為主。在正常粘膜組織中，TNF-α染色后黃色顆粒組織面積較小，證明TNF-α在正常組粘膜組織中的表達(dá)較弱，而在結(jié)腸息肉組織，可觀察到大量的淺黃色顆粒，證明實(shí)驗(yàn)組織中TNF-α表達(dá)較強(qiáng)，尤其在靠近血管的組織附近，表達(dá)明顯增強(qiáng)。

3.2 腫瘤壞死因子α兒童結(jié)腸息肉組織中的表達(dá)

目前，兒童結(jié)腸息肉的病理類型大多為幼年性息肉，但其病因尚不清楚，其中，炎性起源學(xué)說認(rèn)為是由于腸粘膜對(duì)局部刺激的應(yīng)答而產(chǎn)生，認(rèn)為幼年性息肉的形成可能與糞石對(duì)黏膜的慢性損傷有關(guān)，唾黏蛋白和硫酸黏蛋白在幼年性息肉與炎性息肉中有相同分布；同時(shí)在幼年性息肉中觀察到上皮細(xì)胞的再生改變以及突出的間質(zhì)反應(yīng)，包括水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、輕度纖維化和腺體囊性改變[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，免疫組化顯示在實(shí)驗(yàn)組中的TNF-α表達(dá)明顯高于正常粘膜組，而在實(shí)驗(yàn)組中腺瘤性息肉TNF-α的表達(dá)較幼年性息肉無明顯差異，提示TNF-α作為一種炎癥因子可能在息肉或腺瘤的發(fā)生發(fā)展中起了非常重要的作用；另外，本研究發(fā)現(xiàn)在多發(fā)實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)陽性率高于單發(fā)實(shí)驗(yàn)組中的陽性率，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不除外與多發(fā)實(shí)驗(yàn)組樣本量太小有關(guān)；在隨訪觀察中，其中1例復(fù)發(fā)患兒為多發(fā)結(jié)腸息肉，其粘膜組織中TNF-α的表達(dá)為陽性，提示TNF-α可能在息肉的復(fù)發(fā)中亦發(fā)揮作用，但因復(fù)發(fā)樣本小，無法行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，仍需長(zhǎng)期隨訪證實(shí)。

綜上所述，TNF-α作為炎癥的一個(gè)重要細(xì)胞因子，它是炎癥反應(yīng)的發(fā)起者。TNF-α在兒童息肉的發(fā)生發(fā)展中可能起到一定的作用，為今后研究小兒結(jié)腸息肉發(fā)病機(jī)制提供一定的參考意義。在結(jié)腸息肉患兒中，有3%的惡化幾率，因此，在醫(yī)院接診患兒時(shí)，應(yīng)予以全方面的腸道檢查，一旦觀察到有息肉的出現(xiàn)，應(yīng)立即予以切除，從而控制患兒病情。針對(duì)年齡大于10歲的患兒，應(yīng)做到完全切除，不留惡化的隱患，并在治療后進(jìn)行定期病情隨訪。對(duì)于兒童長(zhǎng)期的腹瀉及便秘，應(yīng)及時(shí)糾正，預(yù)防息肉的發(fā)生。

[1]Hood B, Bigler S, Bishop P,etal.Juvenile Polyps and Juvenile Polyp Syndromes in Children: a Clinical and Endoscopic Survey[J]. Hood B1, Bigler S, Bishop P,2011,50(10):910-915.

[2]Wei C, Dayong W, Liqun J,etal.Colorectal polyps in children:a retrospective study of clinical features and the value of ultrasonography in their diagnosis[J]. J Pediatr Surg,2012,47:1853-1858.

[3]王寶香,梅紅,張寅,等.兒童不明原因便血55例臨床分析[J].臨床兒科雜志,2012,30(10):916-919.

[4]張姝翌,王邦茂,譚華,等.環(huán)氧合酶在結(jié)腸腺瘤性息肉及結(jié)腸癌組織中的表達(dá)[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2007,13(2):162-164.

[5]裴祥霄.TNF-α對(duì)肥胖發(fā)生過程脂肪細(xì)胞中chemerin/CMKLR1通路的影響[D].山東師范大學(xué),2012.

[6]李博.表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)聯(lián)合作用對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的研究[D].吉林：吉林大學(xué),2011.

[7]Lee B G, Shin S H, Lee Y A,etal.Juvenile Polyp and Colonoscopic Polypectomy in Childhood[J]. Pediatr Gastroenterol Hepatol Nutr,2012,15(4):250-255.

[8]張莉娜.兒童結(jié)直腸幼年性息肉及其研究進(jìn)展[J].國際兒科學(xué)雜志,2012,39(6):566-568.

[專業(yè)責(zé)任編輯：王寶西]

Expression and clinical significance of TNF-α in children with colon polyps

REN Xiao-xia, FANG Ying, YANG Hong-bin

(Xi’anChildren’sHospital,ShaanxiXi’an710003,China)

Objective To investigate the expression and clinical significance of endogenous tumor necrosis factor alpha (TNF-α) in children with colonic polyps. Methods Serum of 45 cases (experimental group) with colonic polyps and 36 cases (control group) with normal colonic mucosa was detected with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to explore the expression of TNF-α. Immunohistochemical method was used to detect the expression of TNF-α in colonic tissue. The relationship between expression of TNF-α and colonic polyps was analyzed. Results The expression of TNF-α in serum was higher in the experimental group than in the control group (t=5.360,P<0.05), so was in colonic tissue (χ2=10.434,P<0.05). In the experimental group the expression of TNF-α was not significantly different between adenomatous polyp and juvenile polyp (P>0.05). Conclusion High expression of TNF-α in colon polyps suggests that TNF-α may play an important role in the development and progression of colon polyps in children. It may be a marker for judging the prognosis of colon polyps.

tumor necrosis factor alpha (TNF-α); children; colon polyps; pathological diagnosis; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); immunohistochemistry

2015-07-14

任曉俠(1977-)，女，主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事兒童消化道疾病的內(nèi)鏡下診斷及治療。

方 瑩，副主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.05.022

R725.7

A

1673-5293(2015)05-0973-04