陳瀟楷

廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣東東莞523808

小RNA治療流感病毒的研究進(jìn)展

陳瀟楷

廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣東東莞523808

流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，一直以來嚴(yán)重影響人類健康。目前防治流感病毒的常規(guī)方法依然是疫苗和藥物，但存在滯后性、耐藥性等限制。由小RNA（sRNA）介導(dǎo)的RNA干擾（RNAi）提供了一種新型有效的抗病毒策略，已應(yīng)用到SARS、HIV、RSV、HCV等多種病毒的臨床試驗(yàn)。隨著RNAi研究的深入，應(yīng)用sRNA抗流感病毒的報道也逐漸增加。相對于傳統(tǒng)的抗流感病毒藥物，針對流感病毒基因保守區(qū)的特異性siRNAs和miRNAs具有更好的抗病毒效果，并避免耐藥性的產(chǎn)生，具有較好的應(yīng)用前景。

小RNA；流感病毒；siRNA；miRNA

甲型流感病毒容易發(fā)生抗原性轉(zhuǎn)變（antigenic shift）形成新的亞型，如H1N1、H7N9、H10N8［1］，導(dǎo)致流感大流行，嚴(yán)重影響人類健康。疫苗和藥物在一定程度上能抑制流感病毒，改善患者癥狀，但仍存在許多限制。Orozovic等［2］報道抗流感藥物金剛烷胺（Aman tadine）、金剛乙胺（Rimantadine）、扎那米韋（Zanamivir）、奧司他韋（Oseltamivir）均已出現(xiàn)不同程度的耐藥，且耐藥病毒株日益增加。RNA干擾（RNAi）是一種由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）介導(dǎo)的沉默特定基因表達(dá)的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于腫瘤、心血管等疾病的治療。小RNA（RNAs）介導(dǎo)的RNAi具有普遍性、高效性、高度特異性等特點(diǎn)，已開始作為抗病毒治療的候選方案之一［3］。本文就sRNA介導(dǎo)的RNAi在抗流感病毒的作用及應(yīng)用前景進(jìn)行綜述。

1 小RNA概述

sRNA是指不具有蛋白編碼能力，核苷酸長度＜60 nt的RNA。根據(jù)sRNA的來源與作用，主要分為，①microRNA（miRNA）：由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)產(chǎn)生的宿主來源17～24 nt小RNA，能夠在mRNA和蛋白水平上發(fā)揮調(diào)節(jié)作用；②short interfering RNA（siRNA）：由內(nèi)源性Ⅲ型核酸內(nèi)切酶Dicer加工處理多種dsRNA后產(chǎn)生的21～23 nt RNA，通過RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）結(jié)合到與其完全互補(bǔ)的靶位點(diǎn)，介導(dǎo)mRNA沉默；③Piwiinteracting RNAs（piRNAs)：哺乳動物生殖細(xì)胞中分離得到的一類長度約為30 nt的小RNA，與Piwi蛋白家族成員結(jié)合調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和維持mRNA穩(wěn)定性；④virus-derived interfering RNAs（viRNAs）：參與線蟲類、節(jié)肢動物和植物抗病毒固有免疫，如流感病毒小病毒RNA（small viral RNAs，svRNA），是長度為22～27 nt的單鏈RNA，由甲型流感病毒以病毒RNA為模板轉(zhuǎn)錄合成；⑤clustered regularly interspaced short palindromic repeat RNAs（crRNAs）：參與原核細(xì)胞的適應(yīng)性免疫，如細(xì)菌抵御噬菌體的感染［4-5］。

RNA通過序列特異性相互作用，參與mRNA和病原體來源基因組RNA靶位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄，影響靶位點(diǎn)的完整性和功能，廣泛參與細(xì)胞分裂、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)信號傳遞、免疫功能和細(xì)胞運(yùn)動等［6］。在植物和無脊椎動物中，病毒感染能誘發(fā)自然的RNAi實(shí)現(xiàn)抗病毒作用，隨后學(xué)者報道在哺乳動物身上也能通過RNAi發(fā)揮抗病毒作用［7-8］。

2 小RNA作用機(jī)制

RNAi通過dsRNA誘發(fā)的同源mRNA特異性降解或阻礙特定基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯而抑制基因表達(dá)。dsRNA可來源于病毒復(fù)制中間體和病毒基因組的不完全RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)［9］。雙鏈siRNA形成后，在RNA結(jié)合蛋白TRBP的幫助下，與RISC復(fù)合體核心蛋白Ago2結(jié)合，Ago2將siRNA正義鏈切除，而反義鏈與完全互補(bǔ)的靶基因mRNA結(jié)合，通過Ago2裂解靶基因，有效抑制靶基因的表達(dá)［10］。

與siRNA不同，miRNA基因組經(jīng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生初級pri-miRNA，由細(xì)胞核內(nèi)RNaseⅢ家族蛋白Drosa和dsRNA結(jié)合蛋白DGCR等組成的微處理機(jī)復(fù)合體裂解，產(chǎn)生60～70 nt具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的發(fā)夾前體premiRNA，在Ran-GTP依賴的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin 5作用下，從細(xì)胞核運(yùn)輸至胞漿中（圖1）［11］。胞漿內(nèi)的premiRNA由Dicer通過類似于siRNA的方式識別和加工處理，Dicer裂解dsRNA后，反義鏈保留在RISC上，以序列依賴的方式結(jié)合到目的基因mRNA上。結(jié)合miRNA的RISC一般與目的mRNA不完全互補(bǔ)，互補(bǔ)配對高的可對靶mRNA進(jìn)行降解，而配對低的可封閉靶mRNA，抑制翻譯［12］。

3 siRNA與流感病毒

甲型流感病毒是單負(fù)鏈分節(jié)段RNA病毒，具有8個RNA片段，不同RNA片段在病毒復(fù)制和感染中發(fā)揮不同的作用，干擾其中任意一個片段都可以不同程度抑制病毒的復(fù)制［13］。有效的siRNA策略需考慮以下幾個方面：①流感病毒基因組RNA片段由NP蛋白包裹，因此siRNA必須靶定mRNA而不是基因組RNA；②為了使設(shè)計的siRNA能長時間發(fā)揮作用，靶位點(diǎn)應(yīng)是mRNA中最保守的序列［14］。Wu等［15］針對PB2、PB1、NP和M2、M1設(shè)計了10個siRNA，分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，然后以感染復(fù)數(shù)0.001 H1N1病毒液感染細(xì)胞，感染24 h后，RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，10個siRNA均能使靶基因的表達(dá)下調(diào)70%，而只有靶定PB1，PB2和PA的siRNA使NP基因轉(zhuǎn)錄減少70%。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，除了MP-969和MP-559siRNA，其余siRNA均能使NP蛋白減少60%以上。Li等［16］將包含有針對PB1-siRNA的shRNA克隆到pSIREN穿梭載體，并將其轉(zhuǎn)染至MDCK細(xì)胞，然后以感染復(fù)數(shù)0.1的H1N1病毒液（A/ PR/8/34）感染細(xì)胞，48 h后病毒滴度降低了50倍；隨后在雞胚及小鼠上進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)，雞胚尿囊液病毒滴度降低了100倍，小鼠存活率為50%～100%。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，靶向性干擾PB1片段能夠抑制病毒在細(xì)胞和雞胚中的復(fù)制［16］。該實(shí)驗(yàn)為siRNA作為治療流感病毒的候選藥物提供可能性。

雖然還沒有市售的siRNA用于流感的治療，但美國圣諾制藥公司發(fā)展了一種靶向性抑制H1N1和H5N1保守區(qū)域的專利產(chǎn)品——多靶點(diǎn)小核苷酸藥物STP702，目前已在申請臨床試驗(yàn)，其目標(biāo)是開發(fā)針對多種流感病毒株的STP702，包括H1N1、H5N1、H3N2、H7N2和H9N2亞型［17］。另外，將人源化單鏈Fv抗體（humanized single-chain Fv antibody，huscFv）連接到陽離子脂質(zhì)體，構(gòu)成抗流感病毒的免疫脂質(zhì)體siRNA—MDR-03030，顯示出理想的臨床前研究結(jié)果。在小鼠和雪貂模型，通過鼻內(nèi)給予MDR-03030治療甲型流感病毒感染，明顯提高了實(shí)驗(yàn)動物的生存率，此藥物已經(jīng)通過美國FDA審批。使用huscFv作為靶向劑將siRNA傳遞到特定的細(xì)胞，可避免siRNA觸發(fā)的先天性免疫反應(yīng)，增強(qiáng)siRNA傳送效率和特異性，增加了siRNA作為預(yù)防或治療流感病毒感染的可能性［18］。免疫脂質(zhì)體傳遞的成功取決于細(xì)胞抗原是否大量表達(dá)，因此，開發(fā)HA抗體構(gòu)成的免疫脂質(zhì)體，介導(dǎo)抗流感病毒藥物傳遞到病毒感染細(xì)胞是一種具有發(fā)展前景的治療方法。

4 microRNA與流感病毒

miRNA在調(diào)節(jié)病毒生命周期和細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄過程、病毒和宿主相互作用中發(fā)揮重要作用。在病毒感染過程，宿主細(xì)胞內(nèi)miR-449b能調(diào)節(jié)脫乙?；?1的表達(dá)和干擾素-β分泌，進(jìn)而調(diào)控干擾素誘導(dǎo)的抗病毒活性［19］。轉(zhuǎn)染HA miR-192能明顯抑制病毒在MDCK和A549細(xì)胞中的復(fù)制，而且用轉(zhuǎn)染HA miR-192的病毒感染小鼠，即使增加10倍的病毒感染量，在感染8 d后，小鼠存活率為100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HA基因特異性miRNA的表達(dá)能夠抵抗流感病毒的感染并可能預(yù)防病毒引起的疾?。?0］。

Song等［21］研究證實(shí)，miR-323、miR-491和miR-645可靶向H1N1病毒PB1基因的3'非翻譯保守區(qū)，降解PB1基因mRNA，從而抑制H1N1病毒在MDCK細(xì)胞中復(fù)制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這些結(jié)合位點(diǎn)在各種流感病毒毒株中高度保守。也有研究證實(shí)，靶向性結(jié)合H1N1病毒M1基因cRNA3'非翻譯區(qū)的miR let-7c，能調(diào)控M1基因RNA和蛋白表達(dá)，從而抑制H1N1病毒在A549細(xì)胞中的復(fù)制［22］。上述研究提示，針對流感病毒基因片段的靶向性miRNAs具有抵御流感病毒的作用，可能發(fā)展為抗流感病毒藥物。

在人類體液中存在著由細(xì)胞產(chǎn)生的游離miRNA，稱為循環(huán)miRNA。循環(huán)中的miRNA通常包裝成類似于胞外體的微粒，可免受內(nèi)源性RNA酶的降解，使其在體液中高度穩(wěn)定。但在不同的病理?xiàng)l件下，血清miRNA的表達(dá)譜會發(fā)生一定的變化，使其成為一種有效的診斷標(biāo)志物，已用于阿爾茨海默病、冠心病和腫瘤等的診斷［23］。Tambyah等［24］研究報道，在流感病毒H1N1或者H3N2嚴(yán)重感染的50個患者中，有193個miRNA的表達(dá)發(fā)生了顯著變化，其中75個miRNA表達(dá)上調(diào)，118個miRNA表達(dá)下調(diào)，提示miRNA可用于流感病毒感染的診斷。

5 svRNA與流感病毒

svRNA與病毒RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）相互作用，調(diào)控病毒的轉(zhuǎn)錄和翻譯。流感病毒RdRp是由PA、PB1、PB2組成的異源三聚體，在病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等生命周期中具有關(guān)鍵作用。RdRp在A、B、C型流感病毒中高度保守，其功能位點(diǎn)的氨基酸突變對流感病毒是不利的，因此PA、PB1、PB2是重要的抗病毒靶點(diǎn)［25］。svRNA的合成需要功能性RdRp、NP和NEP，缺少任何一個組分都會導(dǎo)致svRNA的合成下降。將攜帶Flag標(biāo)簽的GFP及A型流感病毒蛋白質(zhì)粒PB2，PB1，PA，RdRp，NP及NS1與包含5'三磷酸的非結(jié)構(gòu)svRNA類似物共轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，F(xiàn)lag免疫共沉淀反應(yīng)及Northern blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示svRNA只與完整的RdRp結(jié)合［26］。PA/PB1 X射線結(jié)晶衍射結(jié)果顯示PA表面有個包含K328、K539、R566三個保守堿性氨基酸殘基的凹槽，進(jìn)一步研究證實(shí)凹槽對SvRNA-RdRp間的互動具有重要作用，且R566殘基是svRNA進(jìn)入PA的關(guān)鍵殘基［27］。以上研究表明，svRNA的缺失可能影響RdRp功能的發(fā)揮，可通過下調(diào)svRNA的表達(dá)抑制RdRp活性，提示svRNA可能是一個潛在的抗病毒靶標(biāo)。

6 小結(jié)

與一般的有機(jī)化學(xué)藥物相比，sRNA作為潛在治療藥物具有一定的優(yōu)勢：①siRNA設(shè)計迅速并能大量生產(chǎn)；②sRNA可抑制特定靶基因的表達(dá)，而對宿主沒有影響；③可以使用多種小RNA以減少耐藥性。與此同時，sRNA藥物也存在一些問題，如脫靶效應(yīng)、不穩(wěn)定性和有效性傳遞等［28］。由于sRNA分子量大，親水性強(qiáng)，無法單獨(dú)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞膜，因此傳遞載體是sRNA治療的最大障礙。目前已有多種非病毒性載體如配體偶聯(lián)、與膽固醇共軛結(jié)合、與人源化抗體結(jié)合、脂肽納米粒子，其中脂肽納米粒子在基因沉默方面具有理想效果［29］。

RNAi基因組篩選技術(shù)與生物信息學(xué)的結(jié)合，能夠識別參與流感病毒耐藥性、敏感性和病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄有關(guān)的宿主因子，有助于發(fā)現(xiàn)更多潛在的抗病毒靶點(diǎn)。RNAi干擾技術(shù)不僅僅是基因功能分析的有利工具，同時也是發(fā)展高特異性sRNA基因沉默治療的工具。隨著RNAi技術(shù)的不斷發(fā)展，siRNA、miRNA在流感病毒的治療已從實(shí)驗(yàn)室進(jìn)入到臨床試驗(yàn)，推動RNA在預(yù)防治療流感病毒的進(jìn)程。

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Research advances of sRNA therapy of influenza

CHEN Xiaokai
Department of Biochemistry and Molecular Biology,Guangdong Medical College,Guangdong Province,Dongguan 523808,China

Acute respiratory infections caused by influenza virus affectes human health seriously.Vaccines and drugs are conventional therapies,but there are many restricted factors,for instance,hysteresis and drug resistance.RNA interference(RNAi)mediated by small RNA(sRNA)provides a new,effective antiviral strategy,and it has been used in anti-viruses treatment such as SARS,HIV,RSV and HCV.With gradually researching on RNAi,application of sRNA in anti-influenza virus has been reported increasingly.And compared to conventional anti-virus drugs,the siRNAs and miRNAs which targeting conserved regions of the influenza virus have better inhibitory effect,and hard to produce drug resistance,and thus providing a promising therapeutic agents for anti-influenza virus.

Small RNA;Influenza virus;siRNA;miRNA

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2014-12-14本文編輯：蘇暢）

陳瀟楷（1988.6-），男，廣東醫(yī)學(xué)院2012級臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：抗流感病毒藥物篩選。