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循環(huán)腫瘤細胞檢測技術及臨床應用

曹雅楠，莊文芳，盛慧明*

(上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院 檢驗科，上海200336)

循環(huán)腫瘤細胞(circulatin tumorcells,CTC)計數(shù)有助于早期診斷腫瘤轉(zhuǎn)移，反映患者的治療效果及腫瘤預后。近年來循環(huán)腫瘤細胞檢測的廣泛應用大力推進了相關技術的發(fā)展。本文對近年來外周血循環(huán)腫瘤細胞檢測技術的發(fā)展，臨床及研究領域的應用情況及未來展望做一簡要綜述。

循環(huán)腫瘤細胞(CTC)一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，就得到了廣泛重視，CTC被認為是腫瘤播散轉(zhuǎn)移的標志。研究表明，腫瘤組織每天會釋放大量腫瘤細胞入血，但在循環(huán)中的存活率極低，大多會發(fā)生凋亡，只有少量具有強侵襲力的腫瘤細胞可表達凋亡抑制因子得以存活[1]，這些存活下來的腫瘤細胞即CTC。CTC在外周血中含量極少，一般每106-107個白細胞中僅含有1個。所以，CTC檢測首先要進行細胞富集，以提高檢測靈敏度，再對富集的細胞進行CTC檢測。

1CTC富集技術

1.1　以形態(tài)學為基礎的富集

CTC細胞體積大，直徑超過25 μm,胞核形狀不規(guī)則，核漿比異常。腫瘤細胞體積分離法和核孔分析技術通過濾網(wǎng)可將直徑大于8 μm的腫瘤細胞分離，但此類方法敏感性較低[2]?；诿芏忍荻确蛛x原則的Oncoquick，利用單個核細胞較其它血液成分相比密度低，采用1.077 g/ml的密度梯度將單個核細胞和腫瘤細胞與血液其它成分分離，同時增加設置多孔屏障，進而分離得到更加純化的目的細胞[3]。

1.2　以免疫學為基礎的富集

免疫磁珠法將磁性微珠包被單抗形成免疫磁珠，再結合靶細胞上的對應抗原形成抗原-抗體-磁珠復合物，在外加磁場作用下定向移動、吸附，進而與其它細胞分離。該分離技術的方法有兩種：(1)陽性分離法是直接從細胞混合液中分離出靶細胞；(2)陰性分離法則是利用免疫磁珠去除無關細胞，利用抗CD45抗體或抗CD61抗體去除血液中的巨核細胞和血小板，使靶細胞得以純化[4]。廣泛的陰性分選可選用抗CD2、CD16、CD19、CD36、CD38及血型糖蛋白A抗體等。兩種方法相比較，陽性分離法對腫瘤細胞的富集率較高。免疫學方法與形態(tài)學方法相比，具有操作簡便快速，保持細胞活性，高選擇性等優(yōu)點，而且外加磁場也不會影響分離液中的帶電溶質(zhì)的運動。

如磁性活化細胞分選系統(tǒng)(magnetic activated cell sorting system,MACS)，細胞首先采用胞膜或胞內(nèi)染色，然后通

過免疫磁性標記的微球來捕獲靶細胞。EpCAM是腫瘤相關鈣傳導信號1(CD326)，屬于參與細胞間粘附的細胞表面分子，在多數(shù)上皮腫瘤細胞高表達。磁性微球連接EpCAM可富集上皮來源的CTC，此方法在進行高劑量化療的乳腺癌患者中陽性選擇率較高[5]。

1.3　形態(tài)學基礎和免疫學基礎相結合的富集

還有兼顧上述兩種原理的結合性富集方法，如Rosettesep-applied imaging rare event(RARE)，該方法結合了密度梯度分離和抗體介導分離兩個步驟。首先在陰性分選過程中，CD45陽性細胞與多種紅細胞交聯(lián)結合形成雙特異性四聚抗體復合物，再利用密度梯度離心法將這些復合物去除，CD45陰性的單核細胞即可得以分離[6]。

2CTC檢測技術

2.1　細胞計數(shù)法

最早應用于檢測外周血CTC的方法，基于細胞膜表面的特異分子標志物來分離和計數(shù)CTC。較核酸分離方法，其優(yōu)點在于細胞未被破壞，保持完整，可在形態(tài)學上鑒別惡性表型和在單個細胞水平進行分子特性分析。免疫細胞化學法(immunocytochemistry，ICC)是指以顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和細胞化學呈色反應，對相應抗原進行定位、定性和定量的技術。但此方法敏感性低、檢測繁瑣、易誤診。目前較常用的細胞角蛋白(Cytokeratin，CK)抗體能與巨噬細胞、漿細胞及有核造血細胞前體特異或非特異結合[7]，MUC-1可與紅系祖細胞結合。使用CD45的對比染色使得這種情況有所改善。在乳腺癌中，常使用已有的乳腺癌特異性抗體進行CTC篩選，如HER2、抗乳球蛋白等，但并非所有乳腺癌細胞均表達這些標示物，因此會產(chǎn)生假陰性結果，而多種標志物聯(lián)合使用，能有效提高此方法檢測的敏感性和特異性[8]。近年來，在此方法基礎上發(fā)展出了許多改良技術。其中，光纖陣列掃描術(Fiber-optic Arry Scanning Technology， FAST)配置了擴大視野的光學收集系統(tǒng)，能夠進行連續(xù)掃描，有效避免了純化和富集步驟造成的CTC丟失，能從大量免疫熒光染色的單核細胞中找出CTC。據(jù)報道，利用FAST對三份混入10-21個人結直腸癌HT-29細胞的外周血標本進行檢測，平均敏感性達到98%[9]。鐳射掃描細胞技術器(laser scanning cytometer LSC)則是在聯(lián)合使用抗人上皮抗體和抗CD45抗體標記細胞后，采用前向散射作為其門限參數(shù)分析熒光，使背景熒光改變的修正得以提高，進而提高了其檢測精度，并能在眾多陽性細胞中重新定位CTC，通過顯微鏡進行視覺確認，有效提高了掃描熒光染色細胞的有效率[10]。自動細胞顯像系統(tǒng)(antomated cellular imaging system,ACIS)是一種能更快檢測載玻片的自動掃描顯微鏡，聯(lián)合應用了免疫細胞化學檢測與其他自動掃描系統(tǒng)，使檢測系統(tǒng)具有很好的協(xié)同性，且能在初步掃描和分析結束后進行影像回顧和形態(tài)學分類。

流式細胞術(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)有機的整和了計算機技術、激光技術、電子技術、流體力學、細胞免疫學和單克隆抗體技術等多種高新技術方法，不僅能鑒定特定標本中細胞抗原性和形態(tài)學特征，還能通過分選富集目的細胞，保持細胞形態(tài)和活力，進而對其進行功能學研究。但FCM檢測靶細胞的敏感度約為1/1-10萬，而外周血中CTC數(shù)量常少于1/100萬，因此，CTC的細胞數(shù)量在一定程度上限制了FCM在此領域的應用[11]。

2.2　核酸檢測法

通過檢測腫瘤細胞的特異遺傳學改變來確認CTC的存在，如原癌基因、抑癌基因突變或染色體異常重排，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、致瘤病毒序列等，均可用于檢測。

聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)，是檢測CTC敏感度較高的一種方法，檢出率可達1/(1-10)×106個正常細胞。但是，除了少數(shù)實體腫瘤的染色體突變或基因突變，絕大多數(shù)實體腫瘤的DNA變化沒有明顯的特異性，很少能用于CTC檢測。此外，DNA改變的出現(xiàn)僅存在于混合型損傷以及成熟的腫瘤中，外周血中CTC和核酸的半衰期也不穩(wěn)定，檢測到游離DNA僅能反映核酸的存在，而不能證明是否存在真正的腫瘤細胞，因此應用PCR技術檢測CTC的特異性還有待進一步研究。

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(reverse transcriptase-polymerase chain reaction,rt-PCR)是在PCR基礎上擴增由腫瘤特異性mRNA序列逆轉(zhuǎn)錄的DNA片段，能檢測到組織或腫瘤的特異性mRNA的表達或突變基因的RNA水平異常。這些RNA通常不表達于正常外周血細胞，且半衰期較短，細胞死亡后，RNA可迅速從血中降解，因此檢測到RNA可間接代表完整腫瘤細胞的特性[12]。研究表明，RT-PCR的敏感性要比免疫細胞化學的方法敏感性高很多，可從107-108個外周血單個核細胞中檢測到單個CTC[13]。然而，RT-PCR是以某個腫瘤標志物的mRNA為標志物，目的基因在正常細胞表達以及樣品污染等因素都易使RT-PCR產(chǎn)生假陽性。研究顯示，一些單純炎癥反應也可以引起腫瘤抗原mRNA的升高，所以癌癥患者伴隨炎癥反應也可能會增加RT-PCR方法測定CTC的假陽性率[14]。此外，游離RNA和雜交DNA也可能導致假陽性，影響CTC檢測的特異性[15]。

CTC核酸檢測方法具有高敏感度，但是，由于缺乏真正的腫瘤特異性標志物使得該方法特異性較低，易產(chǎn)生假陽性。近年來，實時定量探針-PCR、實時定量熒光-PCR，巢式定量-PCR等新方法，采用特異探針和實時定量雙重特性，提高了擴增效率和檢測敏感度，目前應用較廣泛，被認為是檢測CTC有效的方法。

3富集和檢測相結合的技術

3.1　CellSearch

是目前美國FDA批準的的唯一一項應用于臨床的CTC檢測技術，廣泛應用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌，肺癌，結直腸癌，肺癌，胃癌，胰腺癌，卵巢癌，膀胱癌等癌癥病人的臨床監(jiān)測。CellSearch 通過載有抗EpCAM抗體的鐵磁流體對CTC進行富集，用DNA染料固定核酸，將CK和DAPI對CTC進行熒光抗體染色，并用CD45，角蛋白8，18和19對其余血細胞進行對比染色。使用自動熒光顯微鏡對CK+/DAPI+/CD45-細胞進行計數(shù)。使用7.5ml的血液樣本可從400多億血細胞中檢測到單個CTC，對轉(zhuǎn)移癌的診斷具有很高特異性，并適用于所有類型的腫瘤細胞。作為一種半自動化檢測工具，此系統(tǒng)既減少了人為因素的誤差，也實現(xiàn)了實驗室之間的結果標準化[16]。受限于缺乏腫瘤特異性抗原，此方法也會存在漏診。此外，使用CellSearch設備，用CD105代替細胞角蛋白抗體能夠計數(shù)內(nèi)皮細胞，研究顯示在轉(zhuǎn)移性腫瘤患者和心血管疾病患者中內(nèi)皮細胞計數(shù)增加[17]。用高分子量黑色素瘤抗體代替細胞角蛋白抗體能夠計數(shù)黑色素瘤細胞[18]，此類細胞出現(xiàn)常意味著臨床預后差。

3.2　上皮免疫斑點法(Epithelia immunospot,EPISPOT)

是酶聯(lián)免疫吸附測定原理發(fā)展的免疫學分析方法。通過免疫磁珠去除CD45+細胞，再用CXCR4(腫瘤細胞歸巢過程中的趨化因子受體)陽性細胞富集CTC[19]。EPISPOT檢測如cathepsin-D(一種半胱氨酸蛋白酶)、Mucirr1等腫瘤患者外周血CTC釋放的特異性蛋白，來計數(shù)分泌這些蛋白的存活的CTC，這些CTC是具有轉(zhuǎn)移潛能的活細胞，較凋亡細胞而言更具臨床相關性[20]。

3.3　CTC芯片(CTC-Chip)

是一種能檢測出血液中極微量癌細胞的微流體硅芯片，在芯片表層排布了78000個包被EpCAM抗體的微位點，當血液標本流過芯片時，該抗體通過抗原-抗體反應捕獲CTC，使得CTC粘附在芯片上。該檢測系統(tǒng)選用CKs和DAPI作為陽性分析指標，CD45作為陰性分析指標。可在10億以上血細胞檢測出單個癌細胞，敏感性非常高，并適用于所有類型腫瘤患者的外周血樣本[21]。第二代CTC-Chip稱為HB-Chip(herringbone-chip)，通過改進該芯片構造，使血液標本流經(jīng)芯片時形成微漩渦，增加了芯片表面包被抗體捕獲CTC的機會，更加有效捕獲數(shù)量極少的CTC，可捕獲血液中90%以上的癌細胞，還能捕捉到其它CTC分離設備未發(fā)現(xiàn)過的腫瘤細胞團塊[22]。此芯片還安裝了一個標準載玻片，使用傳統(tǒng)病理檢查方法鑒別癌細胞，為腫瘤轉(zhuǎn)移機制研究提供了新型平臺。

4CTC檢測臨床應用

4.1　乳腺癌

近年來，在乳腺癌患者骨髓中檢測播散腫瘤細胞(disseminated tumor cells DTC)和外周血中檢測CTC已是腫瘤擴展的研究要點。約30%-40%的初期乳腺癌患者中可檢測到DTC，且檢測結果與臨床預后呈臨床相關性，但由于骨髓穿刺屬于創(chuàng)傷性檢查，外周血CTC檢測成為一種理想的方式。臨床試驗顯示，CTC檢測成為了初發(fā)和轉(zhuǎn)移性腫瘤預后的良好評估指標，且對治療監(jiān)測和腫瘤轉(zhuǎn)移早期生物靶向治療提供了良好指征[23]。在CTC研究領域，乳腺癌的CTC檢測是研究最具體，檢測手段最多的，其臨床價值也得到了廣泛認可。對42例N~O期的乳腺癌患者檢測發(fā)現(xiàn)，CTC總陽性率為48.6%，長期隨訪結果顯示，CTC陽性患者的無病生存期(disease free survival,DFS)、總生存期(overall survival,OS)均較CTC陰性患者短[24]。使用RT-PCR方法對214例術后輔助化療完成的臨床Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌患者進行CTC檢測，總陽性率為21%，隨訪發(fā)現(xiàn)，CTC陽性組發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的概率明顯高于CTC陰性組，且陽性組的無病間隔(disease free interval,DFS)也明顯較陰性組短[25]。對98例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者進行外周血標本的CEA和CA15-3檢測，采用CellSearch進行CTC檢測，結果顯示，45例(45.9%)為CTC陽性，CTC陽性組較陰性組存活率明顯差。71例(72.4%)存在腫瘤標志物(TM)水平增高。在正常TM組中，CTC陽性群體較CTC陰性群體存活率也顯著縮短。因此CTC成為轉(zhuǎn)移性或發(fā)展性乳腺癌患者有力輔助診斷指標。在多因素分析中，CTC檢測可作為唯一的顯著總生存率預測因素[26]。對1944例轉(zhuǎn)移性乳腺癌病人進行CTC檢測研究，其中，911例(46.9%)CTC計數(shù)≥5個/7.5 ml血液組與CTC計數(shù)<5個/7.5 ml血液病人相比較，無惡化生存率和總生存率均有顯著差異。臨床病理預測模型加入CTC計數(shù)因素對生存率預測準確率顯著提高。模型加入治療后3-5周和6-8周的CTC計數(shù)后，準確率進一步提高。而癌胚抗原和CA15-3抗原水平對預測模型無明顯幫助[27]。

大量研究證實，CTC檢測也能反映患者對于治療方案的敏感程度。CellSearch檢測系統(tǒng)對300例中國乳腺癌患者分別在治療前，治療后3-4周，治療后6-8周進行外周血CTC檢測，并繪制無惡化生存曲線PFS，分析CTC動態(tài)變化對PFS改善的關系，結果提示CTC動態(tài)變化能夠預測患者疾病進展風險的改善，并在治療監(jiān)測中具有重要意義[28]。對118例乳腺癌患者進行治療前后CTC水平的聯(lián)合監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，CTC計數(shù)情況與原發(fā)腫瘤情況無直接相關，但可作為早期腫瘤復發(fā)的獨立預后因素[29]。將179例乳腺癌患者分為新輔助療法組(38)，輔助療法組(100)和腫瘤擴散組(41)，采用RT-PCR方法進行檢測，新輔助療法組35%未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的早期乳腺癌患者檢測到CTC陽性，輔助療法組CTC陽性率為26%，腫瘤擴散病人中有43%陽性。在治療后，新輔助療法組陽性率減為5%，輔助療法組減為13%，腫瘤擴散組減為12%。治療后CTC陽性率可以辨別具有高轉(zhuǎn)移風險的病人組，即使對化療前CTC陰性的病人也適用。多元素分析顯示，CTC陽性和臨床病理特征，如腫瘤大小，受體激素狀態(tài)，轉(zhuǎn)移性節(jié)點等無明顯關系。CTC狀態(tài)對于早期乳腺癌管理治療等有顯著意義。另一方面，對乳腺癌病人來說，膜蛋白Her-2的狀態(tài)對于個體化治療意義非凡，臨床常通過手術取出腫瘤進行Her-2狀態(tài)分析，但這并不能代表轉(zhuǎn)移的腫瘤。CTC已經(jīng)被證實在靶向治療中其蛋白和基因水平具有多樣性。而通過對檢測到的CTC進行相關蛋白表達水平的分析，能夠有力指導制定患者個體化治療方案。將來，CTC也將逐步替代一些治療效果監(jiān)測指標，如Bcl-2，Her-2，AR，IGFRI等，成為治療效果評估的重要因素。

4.2　肺癌

微芯片技術在肺癌病人的CTC檢測中研究最深入。與其它實體腫瘤相比，非小細胞性肺癌(NSCLC)患者外周血中CTC相對較少，但由于缺少其它特異性腫瘤標志物，CTC評估對NSCLC的預后評估具有重要意義。據(jù)研究報道，CTC對于轉(zhuǎn)移較快，急需早期診斷的小細胞癌意義更明顯[30]。對50例小細胞肺癌患者檢測CTC計數(shù)，結果顯示其中位數(shù)為28個(每7.5ml)，高于其它類型的肺癌，且CTC計數(shù)越多預后越差[31]。對60例SCLC癌患者進行治療前，第一輪化療后和化療后的CTC檢測，結果顯示，治療前90%(54/60)患者CTC計數(shù)陽性，且CTC計數(shù)與擴散器官數(shù)呈明顯正相關?；熀螅哂?9%的病人CTC減少，且化療后CTC計數(shù)與臨床預后和死亡風險呈顯著相關，證明CTC計數(shù)對擴散性小細胞癌患者預后有顯著意義[32]。對67例骨轉(zhuǎn)移的肺癌患者和30例無轉(zhuǎn)移的肺癌患者進行CTC檢測，及其它臨床資料進行分析，結果顯示，骨轉(zhuǎn)移組與無轉(zhuǎn)移組相比，CTC陽性率顯著增高。CTC技術與其它臨床因素，如年齡，性別，腫瘤類型，肺內(nèi)轉(zhuǎn)移，淋巴結轉(zhuǎn)移等無明顯關聯(lián)，但CTC陽性組肺內(nèi)轉(zhuǎn)移和淋巴結轉(zhuǎn)移發(fā)生率高于CTC陰性組[33]。有報道用微芯片技術分離轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌患者外周血中的CTC，并對其進行EGFR突變和酪氨酸激酶抑制劑耐藥相關基因檢測，檢出率可高達92%，且對分子靶向藥物使用具有良好指導作用[34]。CTC計數(shù)也廣泛應用于肺癌患者療效評估的研究中，例如Martin[35]等就用CTC計數(shù)來監(jiān)測27例非小細胞性肺癌患者對放射治療的敏感情況，從而對患者治療方案進行調(diào)整。

無論在SCLC還是NSCLC中，均證實了CTC計數(shù)是重要的預后因素，且治療前后CTC水平很好的反映了病人對治療的反應情況。而且，CTC的分子水平檢測結果與非小細胞性肺癌的各分子亞型具有良好相關性。例如對8例EGFR突變的肺癌患者研究顯示，無EGFR突變的CTC出現(xiàn)與治療反應相關[36]。在分子水平定義的非小細胞性肺癌亞型中，對CTC的分子水平的檢測也證實了不同亞型間腫瘤細胞的分子水平存在差異。

4.3　其他

近年來，CTC計數(shù)快速發(fā)展，并廣泛應用于各類腫瘤中。雖然許多血清腫瘤標志物如前列腺特異抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)等已經(jīng)廣泛應用于人群的腫瘤篩查，但是普遍存在特異性不高，甚至導致假陽性結果。CTC檢測技術為實體腫瘤的診斷和預后監(jiān)測提供了新的有力手段。Blumke K[37]等對來自兩個研究中心的214名腎癌患者進行腎臟切除前或后，以及化療前后的CTC監(jiān)測和隨訪，結果顯示，62%檢測出CTC的病人兩年內(nèi)發(fā)生了癌細胞擴散或病人死亡。而CTC的出現(xiàn)不僅與腫瘤分期有一定相關性，與腫瘤侵襲力也相關。129例上皮卵巢癌患者進行術前侵略性CTC(iCTC)檢測，結果顯示，對I期和II期的上皮卵巢癌患者而言，iCTC敏感性為41.2%，特異性為95.1%，陽性預測率為77.8%。CA125對I期和II期的上皮卵巢癌患者陽性預測率為61.1%，總預測率為92.1%，特異性為76.2%。且iCTC與血清CA125相比，與總生存率和無惡化生存率相關性更強[38]。另據(jù)報道，在泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤，包括前列腺癌，腎癌，膀胱癌，腎上皮細胞癌，尤其對于切除抵抗的前列腺癌患者是有力的預后工具[39]。CTC能協(xié)助早期診斷腫瘤，小創(chuàng)傷的檢測腫瘤病理變化，并作為治療反應標志物有效幫助臨床調(diào)整治療方案。

此外在胰腺癌、腦癌中，CTC檢測也在逐步應用。對一例轉(zhuǎn)移性腦癌患者腦脊液進行CTC的檢測，證實了此患者轉(zhuǎn)移的腦部腫瘤為乳腺起源，腦脊液的CTC檢測也可作為特殊的標志物用于診斷和治療反應評估[40]。對一例轉(zhuǎn)移性食道癌患者使用CellSearch進行外周血和腹水的CTC檢測，證實了循環(huán)腫瘤細胞的食道癌來源，以及CellSearch 也可應用于腹水的CTC檢測。

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(收稿日期：2014-10-13)

文章編號：1007-4287(2015)07-1223-05

*通訊作者

基金項目:上海市科委自然基金項目(15ZR1437900)資助