■金世杰 李香子 高青山 周 寧 李庚燦 尹云厚 嚴昌國

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉133002；2.貴州民族大學(xué)，貴州貴陽550000）

延邊黃牛是我國的五大地方良種牛之一，肉質(zhì)風(fēng)味獨特。本研究以延邊黃牛為試驗動物，以在各組織中都恒量表達的GAPDH基因為內(nèi)參基因，運用實時熒光定量RT-PCR方法，研究在延邊黃牛肌肉組織SREBP1和SCD1基因表達的發(fā)育性變化，為進一步闡明延邊黃牛肌內(nèi)脂肪沉積，豐富遺傳機制提供理論依據(jù)。SREBP基因作為核轉(zhuǎn)錄因子(Yokoyama等，1993)[1]，目前已經(jīng)被確定為在酯類合成中，尤其是固醇類和脂肪酸合成中的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。SREBP1基因作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族成員之一，在調(diào)控脂肪沉積的同時，還可以調(diào)節(jié)SCD1基因以及其他肌內(nèi)脂肪生成相關(guān)基因的表達水平，從而間接參與脂肪代謝和其生物合成[2]。SCD基因是合成單不飽和脂肪酸MUFA的限速酶，SCD1作為催化飽和脂肪酸去飽和化的關(guān)鍵酶對牛脂肪組織中脂肪酸的組成以及肌肉間脂肪沉積有著重要影響[3-4]。因此，SREBP1及SCD1基因可作為影響肌內(nèi)脂肪沉積的重要遺傳標記，研究其表達水平對改善牛肉品質(zhì)及選育優(yōu)良品種提供可借鑒的遺傳學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集

試驗動物選自延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院牧場，健康無病的12月齡延邊黃牛（去勢）8頭，試驗動物被分為2組，每組4個重復(fù)，所有個體生活環(huán)境一致，接受常規(guī)免疫程序。組織樣品采用微量微創(chuàng)活體采樣槍（韓國忠北大學(xué)提供）方法采集，采集部位為臀部肌肉組織。取樣后迅速放入液氮保存，以備提取總RNA。

1.2 實時熒光定量PCR分析

1.2.1 實驗器皿處理

不同時期肉樣所用的采樣器具及金屬盒玻璃器要分別進行無RNAase處理，不可混用。塑料試管、吸頭等用0.1%DEPC水浸泡24 h以上，然后進行高壓、烘干待用。

1.2.2 總RNA的提取和純化

將肉樣放入研缽中加入液氮充分研磨，按Trizol Regent Kit說明書提取總RNA。

1.2.3 mRNA實時熒光定量

引物的設(shè)計與合成目的基因引物序列根據(jù)Gen-Bank上公布的牛LPL序列進行設(shè)計以GAPDH作為內(nèi)參基因（見表1），引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

表1 用于擴增延邊黃?；蚱蔚膶崟r熒光定量PCR引物

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

利用Taraka公司的Prime Script RT-PCR試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄操作，整個過程全部在冰上完成，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書，建立20 μl反轉(zhuǎn)錄體系。

1.2.5 PCR的擴增反應(yīng)

試驗采用定量的引物來進行常規(guī)的PCR擴增，反應(yīng)體系為20 μl（見表2），整個操作在冰上完成。

表2 PCR擴增反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性4 min，95℃變性30 s，引物的復(fù)性溫度根據(jù)所有引物退火溫度范圍設(shè)置梯度，均在55～60℃之間，持續(xù)時間為30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存，結(jié)束反應(yīng)。

1.2.6 擴增片段的回收及序列分析

用2%的瓊脂糖凝膠電泳將上述產(chǎn)物分離，利用DNA回收試劑盒（Bioteke Corporation）將目的片段回收，通過Blast程序和DNAman軟件分析發(fā)現(xiàn)測序結(jié)果與Genbank中發(fā)表的相應(yīng)序列相同。

1.2.7 實時熒光定量PCR

根據(jù)引物退火溫度，在實時熒光定量PCR儀上設(shè)置55～60℃，5個溫度梯度，觀察其溶解曲線及擴增曲線，找出3個基因適宜的反應(yīng)溫度。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa）對LPL和GAPDH基因進行擴增，反應(yīng)體系如表3所示。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃、15 s；變性95 ℃，5 s；復(fù)性60 ℃，30 s，（40個循環(huán)）；95 ℃，60 s；60℃，60 s。擴增結(jié)束后進行溶解曲線及結(jié)果分析，60℃，10 s（71個循環(huán)）。

表3 熒光定量PCR反應(yīng)體系

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)熒光定量PCR檢測出的內(nèi)參基因和目的基因，利用2-ΔΔCt方法分析基因的相對表達差異量，試驗數(shù)據(jù)一律采用統(tǒng)計軟件SAS（V8.0）中的一般線性模型（GLM）模塊來進行單因素方差分析。表中結(jié)果為“平均數(shù)±標準差”，P<0.05為結(jié)果差異顯著。

1.3 IMF含量的測定

用索氏抽提法測定IMF含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA及目的基因片段檢測結(jié)果

圖1 RNA瓊脂糖凝膠電泳

由圖1可見，將提取的不同部位肌肉組織總RNA進行電泳，將每個階段不同部位樣品總RNA分別經(jīng)紫外分光光度計分析，所有樣本D260/D280均在1.8～2.0。電泳結(jié)果表明，RNA分子保持完整RNA質(zhì)量符合實時熒光定量PCR實驗的要求。

常規(guī)PCR產(chǎn)物檢測，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖2所示。泳道1為SREBP1基因，泳道2為SCD1基因，泳道3為GAPDH基因，3個基因的PCR擴增產(chǎn)物條帶明亮、清晰無雜帶，片段大小均在設(shè)計長度范圍內(nèi)，說明本實驗設(shè)計的引物具有很高的特異性，測序結(jié)果與目的序列一致性為100%，為目的基因片段。

圖2 常規(guī)PCR產(chǎn)物檢測瓊脂糖凝膠電泳

2.2 擴增產(chǎn)物特異性

SREBP1、SCD1和GAPDH基因的標準曲線均在模板濃度為10～10-3的范圍內(nèi)構(gòu)建。SREBP1、SCD1和GAPDH基因的標準曲線如圖3～圖5所示，從圖中可以看出，目的基因和內(nèi)參基因的閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）與起始模板對數(shù)呈線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)分別為0.998和1.000，線性關(guān)系較好，這有利于采用Ct值基因進行準確的定量，同時這也是本試驗的重要參數(shù)。SREBP1、SCD1和GAPDH基因的熔解曲線如圖6～圖8所示，從圖中可以看出，目的基因的溶解曲線上未見雜峰，內(nèi)參基因有雜峰信號出現(xiàn)，可能是引物二聚體或者是非特異性擴增產(chǎn)物，但它們的量與擴增子相比顯得非常少，所以對定量結(jié)果影響不大。SREBP1、SCD1和GAPDH基因的擴增曲線如圖9～圖11所示，橫坐標為待測樣品循環(huán)數(shù)，縱坐標為熒光強度。Ct是在熒光強度有統(tǒng)計學(xué)意義上的增加能被檢測得到時所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)。擴大曲線圖反映了循環(huán)過程中熒光值的變化，即每個循環(huán)Ct值與起始模板濃度的對數(shù)成反比。

圖3 SREBP1標準曲線

圖4 SCD1標準曲線

圖5 GAPDH標準曲線

圖6 SREBP1溶解曲線

圖7 SCD1溶解曲線

圖8 GAPDH溶解曲線

圖9 SREBP1擴增曲線

圖10 SCD1擴增曲線

圖11 GAPDH擴增曲線

2.3 SREBP1基因相對表達變化(見圖12)

從圖12可以看出：SREBP1基因相對表達水平在12、16、20月齡具有及其顯著差異（P<0.01），其中20月齡時SREBP1基因表達量相對最高。

圖12 延邊黃牛SREBP1基因表達的發(fā)育性變化

2.4 SCD1基因相對表達變化(見圖13)

從圖13可以看出：SCD1基因相對表達水平在12、16、20月齡具有顯著差異（P<0.05），其中20月齡時SCD1基因表達量相對最高。

圖13 延邊黃牛SCD1基因表達的發(fā)育性變化

2.5 不同生長階段相同部位肌肉IMF的變化(見表4)

表4 延邊黃牛相同部位不同月齡IMF變化(%)

從表4可以看出，IMF在12、16、20月齡具有顯著差異（P<0.05），其中20月齡時IMF相對最高。

2.6 不同生長階段相同部位肌肉SREBP1和SCD1基因的表達與IFM含量的相關(guān)分析

肌肉組織中SREB1基因的表達量在12～20月齡期間與IMF含量具有正向相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.910(P<0.05)；SCD1基因的表達量在12～20月齡期間與IMF含量具有正向相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.934(P<0.05)。

3 討論

3.1 SREBP1基因的表達以及與IMF含量的關(guān)聯(lián)分析

Sun等（2002）通過蛋白印跡等方法檢測轉(zhuǎn)SREBP1基因小鼠腎臟皮質(zhì)產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)SREBP1蛋白表達相比對照組上調(diào)了大約8倍[10]，Horton等（2003）通過對SREBP1基因過表達小鼠研究還發(fā)現(xiàn)了SREBP1基因過表達會導(dǎo)致小鼠脂肪組織中脂肪細胞肥大、增加細胞內(nèi)脂肪酸的分泌并使小鼠患上脂肪肝，進一步證明SREBP-1是直接參與脂肪代謝調(diào)控途徑的[11]。脂代謝是體內(nèi)脂肪含量多少及成分差異的重要代謝性因素。郝軍等（2010）研究表明，在人腎小管上皮細胞內(nèi)過表達SREBP1基因后，發(fā)現(xiàn)在腎小管上皮細胞內(nèi)出現(xiàn)了明顯的甘油三酯沉積現(xiàn)象，并檢測到SREBP1蛋白和其mRNA的高水平表達[5]，這一現(xiàn)象說明SREBP1基因是甘油三酯代謝中的重要調(diào)控因子，并且SREBP1在轉(zhuǎn)錄水平上可能是調(diào)控多個脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵因素之一(McPherson等,2004)[6]。Zhao等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，SREBP1基因還能夠通過胰島素信號通路對脂質(zhì)代謝進行調(diào)節(jié)[7]。牛SREBP1基因與人類SREBP/a相似度最高。我們的研究結(jié)果表明，延邊黃牛SREBP1基因相對表達水平在12、16、20月齡差異極顯著，其中20月齡時SREBP1基因表達量達到最高,說明延邊黃牛不同生長階段SREBP1基因相對表達水平是不同的。本試驗中SREBP1基因的表達量在12～20月齡期間與IMF含量具有正向相關(guān)性，這與徐麗等（2013）對SREBP1基因過表達可增加牛胎兒骨骼肌成纖維細胞內(nèi)脂肪的合成的結(jié)果相近[9]。我們的試驗結(jié)果表明SREBP1基因表達與延邊黃牛脂肪代謝之間存在一定關(guān)系。

3.2 SCD1基因的表達及其與IMF含量的關(guān)聯(lián)分析

硬脂酰輔酶A去飽和酶1對酶的催化活性至關(guān)重要[13]，是飽和脂肪酸生成單不飽和脂肪酸過程中的限速酶，單不飽和脂肪酸的含量對牛肉的質(zhì)量至關(guān)重要，影響牛肉大理石花紋等級，深加工性能脂肪柔軟度以及肉的風(fēng)味等[12]。Taniguchi等(2004)研究表明SCD1基因的表達對日本黑牛胴體IMF組成和含量影響顯著[14]。Barton等認為捷克西門塔爾公牛SCD1基因的表達與C14∶1和C18∶1脂肪酸的含量以及肌間脂肪含量關(guān)系顯著[17]。Jiang等在Wagyu牛和Limousin牛雜交群體中發(fā)現(xiàn)，SCD1基因3個SNP都與SCD酶活性參數(shù)顯著相關(guān)，與骨骼肌中6個脂肪沉積、脂肪酸組成的性狀也顯著相關(guān)[18]。我們的研究結(jié)果表明，延邊黃牛SCD1基因相對表達水平在12、16、20月齡差異顯著，其中20月齡時SREBP1基因表達量達到最高,說明延邊黃牛不同生長階段SCD1基因相對表達水平是不同的。從本次研究的結(jié)果還可以看出SCD1基因的表達量在12～20月齡期間與IMF含量具有正向相關(guān)性，這與武秀香等（2011）報道的相近[8]，說明SCD1基因表達對肌間脂肪性狀而言是有利基因。

3.3 SREBP1與SCD1的協(xié)同表達

REBP-1是目前在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的SREBPs的3個亞型之一，主要負責調(diào)節(jié)脂肪酸和甘油三酯的代謝[20]。SREBP-1可激活下游多種參與脂肪酸和甘油三酯合成酶的轉(zhuǎn)錄，包括SCD-1脂肪酸合成酶乙酰輔酶A羧化酶等，導(dǎo)致脂肪酸合成增加，造成肝臟脂質(zhì)蓄積[21]，而抑制SREBP-1可以逆轉(zhuǎn)肝臟脂肪變性[22]。SCD-1作為SREBP-1調(diào)控的下游基因，當SREBP-1c轉(zhuǎn)錄因子與SCD-1的啟動子結(jié)合后，可上調(diào)SCD-1基因轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致脂質(zhì)合成增加[26]。本實驗中SREBP1和SCD1在延邊黃牛肌肉中表達存在顯著正相關(guān)，這一結(jié)果驗證了徐擁建等（2014）通過抑制NAFLD大鼠肝細胞SREBP-1/SCD-1信號通路激活，使TC、TG合成減少的相關(guān)報道[27]，說明SREBP-1/SCD-1的協(xié)同表達對延邊黃牛肌間脂肪沉積具有一定影響，不過這也可能是多途徑多層次多環(huán)節(jié)不同機理作用交匯調(diào)控的結(jié)果，所以有關(guān)詳細機制仍有必要作進一步的研究和探討。

4 結(jié)論

①SREBP1和SCD1基因相對表達量在延邊黃牛不同生長階段存在顯著或極顯著差異。

②SREBP1和SCD1基因的協(xié)同表達對延邊黃牛不同生長階段肌內(nèi)脂肪的沉積有一定的正向調(diào)控作用。