■陳姣姣 來航線 馬軍妮 薛泉宏

(西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，陜西楊凌712100)

目前我國普遍采用的養(yǎng)殖模式為高能精飼料喂養(yǎng)。精飼料中蛋白質(zhì)等主要成分對畜禽養(yǎng)殖的重要性不言而喻，但飼料中的纖維成分對維持畜禽營養(yǎng)及健康必不可少。研究表明，精飼料日糧中性洗滌纖維(NDF)過低，導(dǎo)致奶牛物質(zhì)代謝障礙，乳脂率下降及易出現(xiàn)亞急性瘤胃酸中毒[1-2]，引發(fā)母豬便秘及胃潰瘍等問題[3]。適當(dāng)提高NDF水平可彌補精飼料不足，達到促進瘤胃發(fā)酵，提高纖維消化率[4]，改善母豬繁殖性能等效果[5-6]。NDF主要通過影響干物質(zhì)采食量、瘤胃發(fā)酵內(nèi)環(huán)境及營養(yǎng)成分消化率等達到維持畜禽健康的目的。NDF是國內(nèi)外公認(rèn)的評價飼料營養(yǎng)價值的重要指標(biāo)之一。蘋果渣是果汁加工副產(chǎn)品，主要由果皮、果核和殘留果肉組成，富含碳水化合物及礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)物質(zhì)，是重要的飼料原料,但蘋果渣中蛋白質(zhì)含量很低。現(xiàn)有研究重點集中在提高蘋果渣發(fā)酵飼料的蛋白質(zhì)含量的發(fā)酵工藝優(yōu)化[7-8]，而對其中的NDF研究甚少。本文重點研究蘋果渣固態(tài)發(fā)酵對其發(fā)酵產(chǎn)物中NDF的影響，旨在為NDF飼料原料開發(fā)及蘋果渣發(fā)酵飼料營養(yǎng)品質(zhì)綜合評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌種：黑曲霉UA8（Aspergillas niger，縮寫為 An）、白地霉B1410（Geotrichum candidum，縮寫為Gc）、產(chǎn)朊假絲酵母C1314（Candida utilis，縮 寫 為 Cu）及 酵 母 菌（Yeast，縮寫為Y）均由西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院微生物資源研究室保存。

培養(yǎng)基：黑曲霉UA8活化及孢子懸液制備分別用PDA固體培養(yǎng)基及麩皮培養(yǎng)基；白地霉B1410、產(chǎn)朊假絲酵母C1314、酵母菌活化及液體菌種制備分別用PDA固體培養(yǎng)基及PDA液體培養(yǎng)基[9]。

發(fā)酵原料：烘干蘋果渣(眉縣恒興果汁有限公司提供)，玉米漿(商惠酒精廠提供)，尿素在市場購買。原料A為蘋果渣∶尿素=19∶1；原料B為蘋果渣∶玉米漿干粉∶尿素=17∶2∶1。

1.2 方法

發(fā)酵液制備：4株供試菌種經(jīng)PDA固體斜面活化后，用無菌水制成菌懸液，將白地霉、產(chǎn)朊假絲酵母及酵母菌懸液接入PDA液體培養(yǎng)基中，28℃，120 r/min培養(yǎng)72 h，通過血球計數(shù)法測定細胞懸液濃度，再用無菌水稀釋至4.09×108、2.78×108、4.50×108cfu/ml；黑曲霉接入麩皮固體培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)72 h，待孢子大量形成后加入無菌水制備孢子懸液，用無菌紗布過濾后加無菌水調(diào)節(jié)孢子量為4.32×108cfu/ml。

方案：設(shè)發(fā)酵劑、滅菌及原料3個因素。發(fā)酵劑共8種：黑曲霉（An）、白地霉（Gc）、產(chǎn)朊假絲酵母（Cu）、酵母（Y）單菌發(fā)酵劑4種；白地霉+產(chǎn)朊假絲酵母（GcCu）、白地霉+黑曲霉（GcAn）、產(chǎn)朊假絲酵母+黑曲霉(CuAn)及酵母+黑曲霉(YAn)混菌發(fā)酵劑4種。滅菌：設(shè)120℃，30 min濕熱滅菌和不滅菌自然發(fā)酵2種處理。原料設(shè)A（不添加玉米漿干粉）和B（10%玉米漿干粉）2個處理。以未接菌處理作為對照，以烘干純蘋果渣作為發(fā)酵原料對照，每處理重復(fù)3瓶。

固態(tài)發(fā)酵：稱取原料A、B各50.000 g、按料水比1∶2加水拌勻，加入到600 ml組培瓶中,不滅菌處理直接接入發(fā)酵劑（單菌接種量為6 ml，混菌各3 ml），滅菌處理經(jīng)120 ℃，30 min濕熱滅菌，待冷卻后按同樣接種量接入發(fā)酵劑。接種后充分混勻，28℃培養(yǎng)72 h，40℃烘干粉碎備用。

NDF測定：準(zhǔn)確稱取固態(tài)發(fā)酵烘干粉碎樣品0.500 g，加入100 ml中性洗滌劑及2～3滴正辛醇，蓋上玻璃漏斗，快速煮沸并持續(xù)保持微沸1 h。樣品消煮完畢趁熱過濾，先用熱水沖洗至洗液中無泡沫，抽干后用丙酮沖洗至濾液無色，再用乙醚沖洗2次，最后將玻璃砂漏斗和剩余物放入105℃烘箱烘干至恒重[10]。

中性洗滌纖維及發(fā)酵產(chǎn)物中殘留蛋白質(zhì)測定：稱取NDF測定烘干剩余物0.200 g于小三角瓶中,常規(guī)凱氏法消煮,半微量法定氮,再乘以系數(shù)6.25換算為純蛋白質(zhì)[11]。用相同方法測定發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量。

結(jié)果計算：NDF發(fā)酵增率(△f)、接菌增率(△i)、滅菌增率(△s)、玉米漿增率(△r)用下式計算：

式（1）中，Co、Cf分別表示蘋果渣原料、發(fā)酵產(chǎn)物NDF含量；式（2）中，Cck、Ci分別表示未接菌、接菌發(fā)酵后NDF含量；式（3）中，Cn、Cs分別表示未滅菌、滅菌發(fā)酵產(chǎn)物NDF含量。式（4）中，Ca、Cb分別表示原料A、B發(fā)酵產(chǎn)物NDF含量。以上公式中NDF單位均為g/kg。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SAS軟件中的ANOVA程序?qū)?shù)據(jù)進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵劑發(fā)酵產(chǎn)物的NDF（見表1、表2）

表1 自然發(fā)酵產(chǎn)物NDF含量

表2 滅菌發(fā)酵產(chǎn)物NDF含量

由表1可知，在未滅菌自然發(fā)酵條件下，蘋果渣發(fā)酵產(chǎn)物具有較高的NDF含量。在原料A中，發(fā)酵產(chǎn)物的NDF含量為436.16～538.83 g/kg，單菌發(fā)酵劑產(chǎn)朊假絲酵母、白地霉、酵母及混菌發(fā)酵劑黑曲霉+白地霉發(fā)酵產(chǎn)物的NDF含量為493.03～538.83 g/kg，高于其余單菌及混合發(fā)酵劑（436.16～462.00 g/kg）（P<0.05）；單菌黑曲霉An及其他混菌發(fā)酵可使產(chǎn)物中的NDF下降11.8%及0.3%～10.2%。在原料B中，發(fā)酵產(chǎn)物的NDF為444.37～496.73 g/kg,不同發(fā)酵劑發(fā)酵產(chǎn)物的NDF含量均無顯著差異（P>0.05），且較純蘋果渣原料的NDF下降0.6%～10.6%（酵母菌除外）；在所有接種劑中，兩種原料均以單接黑曲霉An處理發(fā)酵產(chǎn)物NDF含量最低。

由表2看出，采用滅菌發(fā)酵模式時，發(fā)酵產(chǎn)物中的NDF含量及在發(fā)酵中的變化與自然發(fā)酵類似。在原料B中，發(fā)酵產(chǎn)物的DNF為414.67～518.00 g/kg，除接種GcCu外，其余發(fā)酵劑及對照處理的發(fā)酵增率△f及接菌增率△i均降低，且各發(fā)酵劑之間無差異顯著（P>0.05）。在原料A中，發(fā)酵產(chǎn)物的DNF為397.61～496.67 g/kg，除An外，其余發(fā)酵劑處理的NDF均無顯著差異。以單接An處理發(fā)酵產(chǎn)物NDF含量降低幅度最大，原料A、B的NDF較不接菌對照分別降低11.0%、12.3%。

在表1、表2中，發(fā)酵增率△f表示發(fā)酵產(chǎn)物與發(fā)酵原料純蘋果渣的差異，接菌增率△i表示接入發(fā)酵劑與不接發(fā)酵劑時發(fā)酵產(chǎn)物中NDF的差異。從表1、表2看出，與蘋果渣原料相比，在發(fā)酵過程中部分NDF分解，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)物中的NDF含量降低；與不接菌相比，接種不同發(fā)酵劑時NDF含量略有差異，但大部分差異未達到顯著水平。

2.2 滅菌對NDF含量的影響

表3 滅菌及玉米漿對NDF含量的影響

由表3△s看出，滅菌可降低發(fā)酵產(chǎn)物中NDF含量。在原料A中，除接種發(fā)酵劑CuAn的NDF較未滅菌處理略有增加（4.4%）外，其余發(fā)酵劑接種處理NDF含量較未滅菌處理降低1.2%～16.3%；在原料B中，除CK、接種劑GcCu及Gc的滅菌增率略有增加外，其余接種處理的降幅為2.8%～8.4%。

2.3 玉米漿對NDF的影響

由表3△r可知，玉米漿對發(fā)酵產(chǎn)物NDF的影響與接菌、滅菌處理有密切的關(guān)系。在自然發(fā)酵條件下，單接菌處理添加玉米漿發(fā)酵產(chǎn)物NDF含量降低，混菌發(fā)酵大部分處理NDF含量增加（CuAn除外)。在滅菌條件下，混菌發(fā)酵處理添加玉米漿發(fā)酵產(chǎn)物NDF含量降低(GcCu除外)，單接菌則相反。因此，在添加玉米漿時，應(yīng)均衡考慮其他條件。

2.4 中性洗滌纖維中的殘留蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)是由氨基酸構(gòu)成的高分子物質(zhì)，僅在酸、堿或蛋白酶的作用下發(fā)生水解反應(yīng)。本試驗采用國標(biāo)提出的中性洗滌纖維分析方法缺少除去蛋白質(zhì)的處理措施，由此推測，用該方法獲得的中性洗滌纖維中會含有較多的殘留蛋白質(zhì)。表4測定結(jié)果證實，由4種代表性發(fā)酵產(chǎn)物處理得到的中性洗滌纖維中確實含有較多蛋白質(zhì)。

表4 滅菌處理原料B發(fā)酵產(chǎn)物及其中性洗滌纖維中蛋白質(zhì)含量

從表4可知，由滅菌處理原料B及其發(fā)酵產(chǎn)物所得中性洗滌纖維中的殘留蛋白質(zhì)含量為30.70～53.32 g/kg，且接菌處理蛋白質(zhì)殘留率高于不接菌對照。

3 討論

本試驗采用白地霉、產(chǎn)朊假絲酵母、酵母及黑曲霉組成的8種發(fā)酵劑進行蘋果渣固態(tài)發(fā)酵。供試菌種對發(fā)酵原料NDF有兩種影響，其一，發(fā)酵初期細胞呼吸和菌體的生長繁殖導(dǎo)致可溶性，碳水化合物被分解利用,殘留物為難以降解的組分，NDF質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加；其二，發(fā)酵過程中由于纖維素酶等水解酶作用NDF含量降低，菌體蛋白形成，蛋白質(zhì)含量提高。黑曲霉生長繁殖過程中合成的大量胞外纖維素復(fù)合酶，將纖維素分解為小分子糖類[12-13]，可達到大幅度降低NDF含量的作用。白地霉、產(chǎn)朊假絲酵母及酵母菌主要作用是將底物中的非蛋白氮及黑曲霉糖化的小分子糖類轉(zhuǎn)化為菌體蛋白，以達到提高蛋白質(zhì)及降低NDF含量的效果。但這些菌種不產(chǎn)纖維素酶，故對NDF含量的降低幅度很小。

蘋果渣原料中加入玉米漿為微生物提供了豐富的營養(yǎng)條件。在滅菌發(fā)酵條件下，黑曲霉與酵母便形成了互利共生關(guān)系，酵母菌消耗黑曲霉酶解產(chǎn)生的簡單糖用于自身的生長繁殖，同時，簡單糖的利用降低了小分子糖對黑曲霉纖維素酶合成代謝的反饋抑制作用，促進了菌體生長和產(chǎn)酶代謝，提高了纖維素酶活性，促進了中性洗滌纖維水解，導(dǎo)致NDF下降。

經(jīng)滅菌處理原料熟化，有利于滅菌處理中接入菌快速生長及水解酶類合成，促進了發(fā)酵產(chǎn)物中大分子碳水化合物水解。因此，滅菌處理下的發(fā)酵產(chǎn)物NDF含量低于自然發(fā)酵。

采用國標(biāo)中性洗滌纖維分析方法對發(fā)酵產(chǎn)物進行分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)該方法處理后的中性洗滌纖維中蛋白質(zhì)殘留量達到30.70～53.32 g/kg，遠高于被認(rèn)為是飼糧纖維的細胞壁鑲嵌蛋白或細胞壁蛋白的含量[14]。推測殘渣中的蛋白質(zhì)可能是中性洗滌劑不能溶解的大分子蛋白及微生物細胞蛋白。故采用國標(biāo)法測定結(jié)果會高估發(fā)酵飼料中NDF含量。建議對該法進行改進研究，增加蛋白質(zhì)的水解過程，消除殘留蛋白質(zhì)對測值的影響，以準(zhǔn)確反映發(fā)酵飼料中NDF含量。

4 結(jié)論

蘋果渣發(fā)酵飼料NDF含量較高，可作為NDF原料用于飼料生產(chǎn)；發(fā)酵對蘋果渣原料中的NDF有降低作用；采用國標(biāo)提出的中性洗滌纖維測定方法測定蘋果渣發(fā)酵產(chǎn)物的NDF含量時，所得NDF測值偏高，其中的殘留蛋白質(zhì)較高。應(yīng)對該方法進行改進研究，增加蛋白質(zhì)酶解措施。