鄧曉娥，平金良，朱平，魯萍，許炳基

（1.長興縣人民醫(yī)院，浙江長興313100；2.湖州市中心醫(yī)院，浙江 湖州313000）

大腸癌組織中Girdin蛋白的表達及與細胞增殖和凋亡的關(guān)系

鄧曉娥1，平金良2，朱平1，魯萍2，許炳基1

（1.長興縣人民醫(yī)院，浙江長興313100；2.湖州市中心醫(yī)院，浙江 湖州313000）

目的檢測大腸癌組織中Girdin蛋白表達及與細胞增殖、凋亡的關(guān)系。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)EnVision二步法檢測84例大腸癌及其正常大腸黏膜組織中Girdin蛋白表達及Ki-67細胞增殖指數(shù)，TUNEL法檢測大腸癌組織中的凋亡指數(shù)，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果 大腸癌組織中Girdin蛋白陽性表達率為42.9%，高于大腸正常黏膜組織的表達率1.19%，且Ki-67增殖指數(shù)高于正常黏膜組織，凋亡指數(shù)低于正常黏膜組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；通過Pearson相關(guān)分析，Girdin蛋白在大腸癌中表達與增殖指數(shù)呈正相關(guān)（r=0.742，P＜0.05），與凋亡指數(shù)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.667，P＜0.05）。結(jié)論 大腸癌組織中Girdin蛋白呈過表達，提示Girdin與大腸腫瘤細胞的增殖、凋亡有關(guān)。

大腸癌；Girdin；細胞增殖；細胞凋亡

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2007年1月1日~2008年12月30日臨床病理資料完整的大腸癌根治手術(shù)標(biāo)本84例（長興縣人民醫(yī)院20例，湖州市中心醫(yī)院64例）。其中，直腸40例，結(jié)腸44例；男49例，女35例；年齡33~82歲，平均56.1歲；組織類型：管狀腺癌57例，乳頭狀腺癌12例，黏液腺癌15例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：共有37例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。組織分級：Ⅰ~Ⅱ級55例，Ⅲ~Ⅳ級29例。Dukes分期：（A+B）期45例，（C+D）期39例。另選取84例的大腸正常黏膜組織作對照，所有樣本均經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋。

1.2方法

1.2.1主要試劑 兔抗人Girdin多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，鼠抗人Ki-67單克隆抗體、EnVision免疫組化試劑盒購自丹麥DAKO公司。TUNEL原位末端標(biāo)記檢測試劑盒為美國Roche公司。4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2免疫組織化學(xué)染色 免疫組織化學(xué)采用En-Vision二步法，按產(chǎn)品說明書操作，操作步驟簡述如下：組織切片經(jīng)脫蠟、脫二甲苯、水化后，0.3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶15分鐘，檸檬酸鈉緩沖液（0.01mol/L，pH6.0）微波抗原修復(fù)10分鐘，冷卻至常溫，滴加一抗（Girdin工作濃度1:100，Ki-67工作濃度1:150），37℃孵育40分鐘，滴加酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物，室溫下孵育30分鐘，滴加二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木精復(fù)染細胞核，常規(guī)脫水、透明、封片、光鏡下觀察。以PBS代替一抗作陰性對照，已知陽性大腸癌切片作陽性對照。

1.2.3TUNEL染色 按TUNEL試劑盒說明進行操作，具體步驟：組織脫蠟至水，2%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶20分鐘，25μg/mL蛋白酶K37℃溫箱消化15分鐘，加平衡液孵育5分鐘，吸干平衡液，加TdT工

作液，加蓋玻片37℃孵育1小時，加檸檬酸緩沖5分鐘，過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體37℃孵育45分鐘，NBT/BCIP避光顯色，復(fù)染、脫水透明、封片。

1.3結(jié)果判定

1.3.1Girdin蛋白免疫組化染色 由2名高年資病理醫(yī)師采用雙盲法閱片進行判定。Girdin蛋白以細胞質(zhì)和（或）細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達，染色結(jié)果綜合染色強度及陽性細胞數(shù)進行分析，染色強度積分分值（IRS）=SI×PP。SI表示染色強度：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；PP表示陽性細胞數(shù)百分比：無陽性細胞為0分，＜10%為1分，10%~50%為2分，＞50%為3分，積分分值（IRS）0~1分為陰性（-），2~ 3分為弱陽性（+），4~5分為中度陽性（++），≥6分為強陽性（+++）。

鮮食玉米以甜玉米和甜糯型玉米為主，種植鮮食玉米品種除了和普通玉米一樣管理外，還要特別抓好以下五項關(guān)鍵技術(shù)：

1.3.2細胞增殖和凋亡指數(shù) 細胞增殖以Ki-67在細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡顯示為細胞核陽性物質(zhì)呈紫藍色顆粒狀，綜合細胞核染色陽性情況及凋亡細胞的形態(tài)特征（染色質(zhì)濃縮，無明顯的炎癥反應(yīng)等）綜合判定細胞的凋亡。每例隨機選擇5個高倍視野（10×40）計數(shù)1000個細胞，計算增殖細胞和凋亡細胞的百分率，即為增殖指數(shù)和凋亡指數(shù)。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件，Girdin蛋白與大腸癌臨床病理指標(biāo)之間關(guān)系采用χ2檢驗，Girdin蛋白與增殖指數(shù)和凋亡指數(shù)間關(guān)系采用t檢驗和Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1Girdin蛋白表達以及Ki-67指數(shù)和凋亡指數(shù)

大腸癌組織中表達Girdin蛋白陽性表達棕黃色顆粒位于細胞質(zhì)和（或）細胞核，呈異質(zhì)性。在大腸癌組織中Girdin蛋白36例呈陽性表達，其中弱陽性（+）14例，中度陽性（++）12例，強陽性（+++）10例，總陽性表達率為42.9%。大腸癌組織中Girdin蛋白陽性表達遠高于正常黏膜組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），且其Ki-67高于正常黏膜組織，凋亡指數(shù)低于正常黏膜組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見表1、圖1~2。

2.2Girdin蛋白表達與腫瘤細胞增殖、凋亡的關(guān)系大腸癌組織中Ki-67陽性表達定位于細胞核，呈棕黃色顆粒（圖3），凋亡小體位于細胞核，呈散在性分布，TUNEL染色陽性信號呈紫藍色，周邊無炎性反應(yīng)（圖4）。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，Girdin蛋白表達陽性與陰性組Ki-67和凋亡指數(shù)的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。通過Pearson相關(guān)分析，Girdin蛋白在大腸癌中表達與增殖指數(shù)呈正相關(guān)（r=0.742，P＜0.05），與凋亡指數(shù)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.667，P＜0.05）。詳見表2。

表2 Girdin蛋白表達與Ki-67和凋亡指數(shù)的關(guān)系（）

與陰性比較**P＜0.01

Girdin蛋白 n Ki-67 凋亡指數(shù)陽性 36 51.44±12.92**1.29±0.32**陰性 48 25.75±11.57 1.93±0.42

3 討論

Girdin是1個多結(jié)構(gòu)域的信號分子，由1870個氨基酸組成的大分子蛋白，又名AKt磷酸化增強子（Akt-phosphoylation enhancer，APE）。研究發(fā)現(xiàn)[2]，Girdin能夠促進細胞DNA的合成，抑制細胞凋亡，并能夠影響腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成等。Jiang等[2]通過檢測180例惡性腫瘤的組織樣本，包括乳腺癌，肺癌、子宮頸癌和甲狀腺癌等，發(fā)現(xiàn)Girdin在以上惡性腫瘤組織中均有不同程度的表達，表達率達10%~50%。Jun等[3]利用免疫組織化學(xué)檢測242例結(jié)腸癌標(biāo)本Girdin蛋白表達，陽性率為27.3%，并通過臨床單因素或多因素相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)Girdin蛋白表達與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移和侵襲具有相關(guān)性，且在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中表達陽性率較

高。Liu等[4]報道結(jié)腸癌組織Girdin蛋白陽性表達率為37.0%。Garcia-Marcos等[5]報道Girdin蛋白表達缺失時，其5年生存率幾乎為100%，而當(dāng)Girdin蛋白表達時，結(jié)直腸癌患者5年生存率僅為62%。本研究結(jié)果顯示，Girdin蛋白在大腸癌中呈高表達，陽性率為42.9%，而在正常大腸黏膜中僅1例為弱陽性，提示Girdin與大腸癌發(fā)生存在一定關(guān)系。

惡性腫瘤細胞具有生長迅速、增殖能力增強和凋亡下降等特點，細胞凋亡是一個復(fù)雜的過程，受多種因素影響。AKt具有促進細胞增殖、抑制細胞凋亡的作用，Girdin作為AKt磷酸化增強蛋白，可通過調(diào)節(jié)AKt的活性參與細胞增殖和凋亡過程[6]。Enomoto等[7]發(fā)現(xiàn)，siRNA介導(dǎo)的Girdin表達抑制導(dǎo)致了DNA合成的減少。王靜等[8]在惡性膠質(zhì)瘤研究中發(fā)現(xiàn)Girdin具有促進細胞增殖，抑制腫瘤細胞凋亡的功能。本實驗結(jié)果顯示，在大腸癌組織中，Girdin蛋白陽性組中細胞增殖指數(shù)為51.44±12.92，明顯高于陰性組25.75±11.57，而Girdin蛋白陽性組凋亡指數(shù)為1.29±0.32，明顯低于陰性組1.93± 0.42，Girdin蛋白在大腸癌中表達與細胞增殖呈正相關(guān)，細胞凋亡負(fù)相關(guān)性，提示Girdin在大腸癌腫瘤細胞的增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用，其過程中作用機制尚待進一步研究。

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湖州市科學(xué)技術(shù)局計劃項目（2013GY35）