譚元生，唐文利，王順民，張 穩(wěn)

20世紀(jì)末有研究表明，血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）過度生長是高血壓條件下血管重構(gòu)的經(jīng)典機(jī)制［1，2］。平滑肌細(xì)胞異常增殖和纖維化引起血管壁增厚和管腔狹窄，造成血管重構(gòu)，可促進(jìn)高血壓等疾病的形成和發(fā)展，并可影響心、腦、腎等重要器官的結(jié)構(gòu)與功能，最終導(dǎo)致這些器官功能衰竭，是導(dǎo)致心血管疾病死亡的主要原因之一。近年來隨著研究進(jìn)展的深入，抑制血管平滑肌增殖對(duì)心腦血管疾病的預(yù)防受到越來越多學(xué)者的關(guān)注。體外培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞是研究血管平滑肌細(xì)胞生物特性的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)利用SD大鼠腹主動(dòng)脈成功分離、培養(yǎng)出血管平滑肌細(xì)胞，希望能為該類實(shí)驗(yàn)研究提供純度高、結(jié)構(gòu)和功能良好的平滑肌細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體重（100～150）g（由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）。

1.2 儀器與試劑 倒置相差顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠，中國）；熒光倒置顯微鏡（OLYMPUS公司，日本）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo Forma公司，美國）；胎牛血清（杭州四季青生物制品公司，中國）；DMEM 培養(yǎng)基（Hy－clon公司）；胰酶細(xì)胞消化（Trypsin－EDTA Solution）含0.25%胰酶和0.02%EDTA （碧云天，美國）；小鼠抗大鼠SMα－actin單克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司，中國）；即用型SABC免疫組化染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，中國）；3，3’－氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，中國）；青霉素鈉、硫酸鏈霉素（碧云天，中國）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

1.3.1 原代培養(yǎng) 將SD大鼠斷頸處死，在無菌條件下取其腹主動(dòng)脈段，立即置于含青霉素鈉、硫酸鏈霉素的無菌PBS液體中。將其移入超凈工作臺(tái)上，在盛有PBS液的培養(yǎng)皿上清除結(jié)締組織，完整剝除動(dòng)脈外膜。用PBS液漂洗（2～3）次后，縱向剖開血管，將血管內(nèi)膜面向上平鋪于培養(yǎng)皿上，用眼科彎鑷鈍性刮除內(nèi)膜，以去除內(nèi)皮細(xì)胞，動(dòng)作輕柔以免破壞血管中膜。剪去血管兩端鉗夾過的組織，再用PBS液清洗3次，放入盛有含20%胎牛血清、青霉素鈉100U／mL，硫酸鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，用眼科彎剪反復(fù)將其剪成1 mm×1mm左右的小組織塊，用彎頭吸管移入培養(yǎng)瓶中。以0.5cm左右的間距將組織塊均勻分布于培養(yǎng)瓶底部。輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，讓瓶底朝上并向瓶內(nèi)注入含20%胎牛血清、青霉素鈉100U／mL，硫酸鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液（3～4）mL，然后瓶蓋旋松，置于CO2培養(yǎng)箱中靜置5h～6h使組織塊干涸并與瓶底貼壁附著后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，使組織塊完全浸入培養(yǎng)液中，繼續(xù)靜置于（37℃，5%CO2，95%空氣，保持一定濕度）CO2培養(yǎng)箱中3d～5d。待有細(xì)胞從組織塊周圍游出后換液，以后2d～3d換液1次。

1.3.2 細(xì)胞換液 當(dāng)細(xì)胞增殖旺盛，培養(yǎng)液由桃紅色變?yōu)辄S色時(shí)，則需換液。在超凈工作臺(tái)上，吸棄原培養(yǎng)基，用PBS液輕輕沖洗2遍后，加入新鮮含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基4mL繼續(xù)培養(yǎng)，也可進(jìn)行半量或1／3量換液。換液時(shí)應(yīng)動(dòng)作輕柔，盡量不要碰到組織塊。

1.3.3 細(xì)胞傳代 至單層細(xì)胞鋪滿近培養(yǎng)瓶底的80%～90%以上傳代。將原代細(xì)胞瓶內(nèi)的培養(yǎng)液小心吸棄，加入PBS液2mL輕晃培養(yǎng)瓶沖洗細(xì)胞2次，吸棄，加0.25%胰酶液2mL在37℃消化約40s。在倒置顯微鏡下見細(xì)胞回縮、變圓，細(xì)胞成片收縮呈球形時(shí)，立即加入含血清培養(yǎng)基終止消化。然后輕輕吹打瓶壁細(xì)胞使其完全脫落，形成的細(xì)胞懸液在鏡下計(jì)數(shù)，按1∶2接種。周期為5d～7d。首次傳代時(shí)，脫落的組織塊可以轉(zhuǎn)移到新的25cm培養(yǎng)瓶中，靜置于37℃的CO2孵箱中，按原代培養(yǎng)方法使組織塊重新貼壁。24h后可見細(xì)胞重新貼壁生長。以后2d～3d換液1次，1周左右后細(xì)胞再次長成致密單層時(shí)即可再次傳代。未消失的組織塊會(huì)隨細(xì)胞換液、傳代而除去，待細(xì)胞傳代至（4～7）代，即可用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 平滑肌細(xì)胞鑒定

1.4.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞大小、形態(tài)、生長特點(diǎn)及排列方式等。

1.4.2 細(xì)胞存活率的檢測(cè) 消化傳代的細(xì)胞懸液9滴，加入1滴0.4%臺(tái)盼藍(lán)液，混勻后3min內(nèi)吸取1滴于血球計(jì)數(shù)器上，置顯微鏡下觀察，凡著色細(xì)胞均為不正常細(xì)胞或死亡細(xì)胞。共計(jì)數(shù)1 046個(gè)細(xì)胞。

1.4.3 細(xì)胞免疫組化 第5代對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞懸液接種到（先放置2張7mm×22mm蓋玻片）培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)2d～3d取出蓋玻片，PBS漂洗5min×3次，4%的多聚甲醛室溫下固定（20～30）min，PBS再次漂洗5min，3次，然后按照即用型SABC免疫組化染色試劑盒和DAB顯色試劑盒說明書逐條進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1 平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察 原代培養(yǎng)6d～7d，倒置顯微鏡下可觀察到少量細(xì)胞自組織塊邊緣游出，形態(tài)呈梭形或長梭形，但不是所有的組織塊周邊都有，漸向外生長形成細(xì)胞暈，進(jìn)而形成細(xì)胞簇，大小略有差異。傳代后80%～90%的細(xì)胞可重新貼壁生長，繼續(xù)培養(yǎng)，數(shù)量逐漸增加，4d～6d后長成致密細(xì)胞層，出現(xiàn)“峰－谷”狀結(jié)構(gòu)細(xì)胞恢復(fù)為梭形或長梭形外觀，細(xì)胞大小趨于一致。

2.2 細(xì)胞存活率 臺(tái)盼藍(lán)液染色共計(jì)數(shù)1 046個(gè)細(xì)胞，其中30個(gè)陽性，約有95%以上的細(xì)胞染色呈陰性，表明培養(yǎng)的細(xì)胞消化傳代后成活率較高。

2.3 細(xì)胞組織學(xué)鑒定 培養(yǎng)第5代的細(xì)胞經(jīng)特異的SMα－actin免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，胞漿著棕黃色，呈陽性表達(dá)。結(jié)果表明，所得細(xì)胞為典型的平滑肌細(xì)胞。

3 討 論

血管平滑肌細(xì)胞是構(gòu)成血管壁組織結(jié)構(gòu)及維持血管張力的主要細(xì)胞成分，其結(jié)構(gòu)和功能的改變是導(dǎo)致高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和血管成形術(shù)后再狹窄等多種心血管病的細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)［3］。目前常用的血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)方法有酶消化法［4］和組織貼塊法。其中，酶消化法由于所需組織量較大、實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜、消化酶價(jià)格昂貴、酶作用時(shí)間不易掌握、消化酶本身對(duì)細(xì)胞有毒性作用等原因，常常不是細(xì)胞培養(yǎng)的首選方法。而組織貼塊法具有操作簡單易行、存活率較高、純度較高、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，成為許多研究者獲取原代平滑肌細(xì)胞的重要途徑。本研究采用了組織塊培養(yǎng)法，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及免疫組化方法鑒定和臺(tái)盼藍(lán)液染色檢查細(xì)胞成活率高，形態(tài)學(xué)和功能良好。

本實(shí)驗(yàn)體會(huì)有：①每次實(shí)驗(yàn)前要仔細(xì)檢查準(zhǔn)備工作，制定具體實(shí)驗(yàn)步驟，先把本次實(shí)驗(yàn)所需的PBS、DMEM培養(yǎng)液、實(shí)驗(yàn)藥品配制，分裝好并移入超凈工作臺(tái)，檢查酒精燈、酒精棉球等消毒用品，紫外下消毒30min。②嚴(yán)格無菌操作過程。包括實(shí)驗(yàn)環(huán)境與操作臺(tái)面消毒、試劑消毒，以及洗手、關(guān)門、換鞋換衣等細(xì)節(jié)，處死動(dòng)物后用75%酒精浸泡6min，取動(dòng)脈宜在細(xì)胞培養(yǎng)室超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。③在貼壁法培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞過程中，仍然存在一些需要注意的問題：取材時(shí)嚴(yán)格無菌操作，動(dòng)作輕柔，避免大力牽拉血管造成損傷，不利于后期細(xì)胞的生長。④組織塊不應(yīng)剪切過小，1mm×1mm大小適中，組織邊緣要求整齊、光滑，這樣利于細(xì)胞從組織塊中游離出和生長。組織塊間距應(yīng)為5mm，以保證細(xì)胞從組織塊游出后有足夠的生長空間并保持局部細(xì)胞密度的均勻，從而獲得盡量多的原代細(xì)胞。

因此，在今后的類似實(shí)驗(yàn)中研究者應(yīng)不斷在實(shí)踐中摸索、改進(jìn)，為獲取純度、存活率高的平滑肌細(xì)胞提供扎實(shí)的基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)流程，整個(gè)過程嚴(yán)格無菌操作，最終通過實(shí)驗(yàn)鑒定，獲得了較為理想的大鼠腹主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，為接下來即將進(jìn)行中藥含藥血清干預(yù)平滑肌細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)提供了存活率、純度都較高的實(shí)驗(yàn)材料。

［1］ 楊傳華，陸峰，張翠英.高血壓血管重塑與絡(luò)病的相關(guān)性［J］.山東中醫(yī)雜志，2005，24（11）：643－645.

［2］ Gohlke P，Lamberty V，KuwerL，etal.Vascularre modeling insystemic hypertension［J］.Am J Cardiol，1993，71：2E－7E.

［3］ 戴恩來，薛國忠，武俊斌，等.大鼠血管平滑肌細(xì)胞的貼塊法培養(yǎng)［J］.中國兒科雜志，2007，3（2）：47－48.

［4］ 王明勇，陳楓，陳莊.酶消化法分離老齡SD大鼠血管平滑肌細(xì)胞［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2011，12（40）：3482－3483.