陳雪林 邢俊蓬 馬亮亮 崔嘉 劉宇 黑文明

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·短篇論著·

γ干擾素釋放試驗新試劑的臨床應用研究

陳雪林 邢俊蓬 馬亮亮 崔嘉 劉宇 黑文明

如何快速、準確診斷結核病一直是臨床關注的問題。近年來，γ干擾素釋放試驗(interferon-gamma release assays，IGRAs)作為一種新的輔助診斷結核分枝桿菌感染的免疫學方法，已經被廣泛認可并應用于臨床[1]；并且IGRAs對肺外結核、結核性胸膜炎的輔助診斷具有較高的敏感度和特異度[1-2]。目前IGRAs檢測試劑有國產化傾向，武漢海吉力生物科技有限公司研制的結核分枝桿菌特異性細胞免疫反應檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附法)(簡稱“海吉力試劑”)，能夠檢測外周血的γ干擾素水平，與北京萬泰生物藥業(yè)有限公司生產的結核分枝桿菌相關γ-干擾素檢測試劑盒(體外酶聯(lián)免疫法)(簡稱“萬泰試劑”)的檢測原理一致，均選取了卡介苗及大多數非結核分枝桿菌沒有的早期分泌抗原靶6(ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)作為結核分枝桿菌特異性抗原[3]，均可用于結核分枝桿菌潛伏感染或活動性感染的輔助診斷。本研究對海吉力試劑與萬泰試劑在結核病診斷中的敏感度、特異度、一致率進行臨床驗證，結合臨床資料探討IGRAs對結核病患者的診斷價值。

對象和方法

1.對象：2013年1—4月在北京老年醫(yī)院結核門診、感染疾病科、呼吸科、腫瘤科招募研究對象，共入選結核病患者220例(結核病組)。其中涂陽或培陽結核病患者93例(菌陽組)，菌陰結核病患者127例(菌陰組)；男147例，女73例；年齡15～90歲，中位年齡36.0歲，其中≥60歲的老年患者44例；患者中肺結核181例(包括糖尿病合并肺結核患者20例)，結核性胸膜炎25例，肺外結核14例。

共入選非結核肺部疾病患者86例(非結核肺部疾病組)。其中男56例，女30例；年齡19～96歲，中位年齡72.0歲，其中≥60歲的老年患者59例；患者中肺炎54例，肺癌24例，慢性阻塞性肺疾病8例。

結核病的診斷標準參見文獻[4]，同時綜合考慮臨床表現、影像學、組織病理學、抗結核治療效果等，做出明確診斷。本研究獲得我院倫理委員會審核通過，所有患者均簽署知情同意書。

2.方法：每位入選受試者的全血標本用海吉力試劑與萬泰試劑進行同步檢測。

海吉力試劑檢測步驟：用肝素鋰抗凝采血管抽取靜脈血>4 ml并馬上顛倒混勻3次以上，使抗凝充分；3 h內將全血分裝到以下3種管中，每管分裝1 ml，以“N”標記本底對照培養(yǎng)管，以“T”標記加了結核特異性抗原ESAT-6、CFP-10的測試培養(yǎng)管，以“P”標記加了非特異刺激原植物血球凝集素(PHA)的陽性對照培養(yǎng)管；分裝前需要顛倒混勻3次以上，分裝后輕柔顛倒培養(yǎng)管5次并立刻置于37 ℃培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)(22±2)h后取出，離心收集上清液，然后用Multiskan MK3全自動免疫檢測儀(上海賽默飛世爾儀器有限公司生產)檢測其中γ干擾素的含量，再按說明書計算刺激培養(yǎng)系統(tǒng)中升高的γ干擾素的量來判定是否為結核分枝桿菌感染陽性。結果判定如下(參照說明書)：本底對照培養(yǎng)管γ干擾素含量值=N、測試培養(yǎng)管γ干擾素含量值=T、陽性對照培養(yǎng)管γ干擾素含量值=P(單位為IU/ml)；N≤8，T-N≥0.35并且≥N/4為陽性；N≤8，P-N≥0.5，T-N<0.35或≥0.35但

萬泰試劑(批號TR20121205)檢測步驟：檢測步驟同上，結果計算(參照說明書)和判定的參考值如下：本底對照培養(yǎng)管γ干擾素含量值=N、測試培養(yǎng)管γ干擾素含量值=T、陽性對照培養(yǎng)管γ干擾素含量值=P(單位為pg/ml)；N≤400，T-N≥14并且≥N/4為陽性；N≤400，P-N≥20，T-N<14或≥14但400為不確定。

3.統(tǒng)計學分析：采用SPSS 13.0軟件進行分析。計數資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。一致率檢驗采用Kappa檢驗，Kappa值≥0.75為一致率高。

結 果

1. 海吉力試劑與萬泰試劑在結核病組、菌陽組、菌陰組的敏感度分別為80.9%(178/220)、79.6%(74/93)、81.9%(104/127)和78.2%(172/220)、77.4%(72/93)、78.7%(100/127)，差異均無統(tǒng)計學意義(Fisher確切概率法，P值分別為0.307、0.727、0.454)；海吉力試劑與萬泰試劑在非結核肺部疾病組檢測結果的敏感度分別為27.9%(24/86)、33.7%(29/86)，特異度分別為72.1%(62/86)、66.3%(57/86)，差異無統(tǒng)計學意義(Fisher確切概率法，P=0.125)。菌陰組與菌陽組的敏感度差異均無統(tǒng)計學意義(海吉力試劑：χ2=1.426，P=0.274；萬泰試劑：χ2=0.289，P=0.625)。

2. 海吉力試劑與萬泰試劑的一致率比較：兩種試劑同時檢測的306例樣本中，均為陽性186例，均為陰性89例，結果一致率為89.9%(275/306)，Kappa值為0.775，具有很高的一致率。

3. 其他結果：海吉力試劑在肺結核、結核性胸膜炎患者中的敏感度分別為80.7%(146/181)、80.0%(20/25)，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.057，P=0.805)；萬泰試劑在肺結核、結核性胸膜炎患者中的敏感度分別為77.3%(140/181)、80.0%(20/25)，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.207，P=0.314)；兩者在糖尿病合并結核病患者中的敏感度分別為85.0%(17/20)、80.0%(16/20)，與未合并糖尿病的結核病患者中的敏感度比較，差異無統(tǒng)計學意義(海吉力試劑χ2=2.037，P=0. 152；萬泰試劑χ2=0.671，P=0.439)。海吉力試劑在老年結核病患者的敏感度為61.4%(27/44)，低于在中青年結核病患者中的敏感度(84.7%，149/176)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.012，P=0.005)；萬泰試劑在老年結核病患者中的敏感度為61.4%(27/44)，低于在中青年結核病患者中的敏感度(81.2%，143/176)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.856，P=0.028)。

討 論

1.γ干擾素釋放試驗在結核病診斷中的現狀：目前IGRAs已有2個商業(yè)化試劑盒，即用酶聯(lián)免疫吸附法檢測的IFN-γ定量試驗(QuantiFERON TB Gold In Tube，QFT GIT)和用酶聯(lián)免疫斑點法檢測的T-SPOT.TB試劑盒，主要目的是用于診斷結核潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)，近年來在結核病臨床診斷中的應用越來越廣[5]，對活動性結核病，尤其是肺外結核(結核性胸膜炎、淋巴結結核、骨關節(jié)結核等)也有輔助診斷價值[1-2，6-7]；但IGRAs檢測結果受到外周血淋巴細胞絕對值、病變累及范圍、年齡等因素的影響[8-9]，IGRAs檢測試劑價格貴，國產IGRAs檢測試劑的應用和報道較少；本研究使用的海吉力試劑與萬泰試劑屬前一種定量試驗方法，均為國產試劑。

2.本研究的結果分析：海吉力試劑、萬泰試劑對結核病組檢測的敏感度分別為80.9%、78.2%，與結核病臨床診治進展年度報告(2013年)[5]中“Khalil等研究顯示QFT-GIT診斷活動性結核病的敏感度為80%”的結論一致；兩種試劑均對菌陽與菌陰結核病患者檢測的敏感度差異無統(tǒng)計學意義，但有臨床意義，有助于緩解菌陰結核病的診斷難題，提示IGRAs對菌陰結核病的診斷價值較高，與楊新婷等[8]報道“γ干擾素釋放試驗中IFN-γ分泌量不受菌量負荷影響”的結論一致；本研究中兩種試劑對非結核肺部疾病患者檢測的陽性率均高于國內李紅等[10]報道的“T-SPOT.TB對非結核肺部疾病患者檢測的陽性率[19.2%(30/156)]”，以此為對照，對結核病組診斷的特異度稍低于國內報道的“IGRAs診斷活動性結核病的特異度為78.1%～90.4%”[2,6-7,9-10]，可能說明我院(為結核病定點醫(yī)院)非結核肺部疾病患者的結核潛伏感染率較高，提示在非結核肺部疾病患者中IGRAs檢測結果陰性的排除診斷價值大于檢測結果陽性的診斷價值；海吉力試劑和萬泰試劑均對糖尿病合并結核病患者檢測的敏感度較好，與未合并糖尿病的結核病患者的敏感度比較差異均無統(tǒng)計學意義，有較好的臨床應用價值；在老年結核病患者中，海吉力試劑和萬泰試劑檢測的敏感度均低于在中青年結核病患者的敏感度，表明IGRAs對老年結核病患者的臨床診斷價值相對較低。

綜上所述，本次IGRAs新試劑的臨床研究表明：海吉力試劑與萬泰試劑對活動性結核病診斷的敏感度較高，以非結核肺部疾病為對照對結核病診斷的特異度稍低；兩種試劑具有較好的一致性；IGRAs不失為快速、有效診斷各型結核病的輔助手段，尤其對菌陰結核病、糖尿病合并結核病患者的應用價值更高，對老年結核病患者的診斷價值相對較低；目前該技術的國產試劑適宜推廣應用。

[1] 葛燕萍，肖和平.γ干擾素釋放試驗與結核菌素皮膚試驗輔助檢測肺外結核病的比較.中國防癆雜志，2014,36(3)：194-197.

[2] 劉菲，張霞，杜鳳嬌，等. γ-干擾素釋放試驗檢測胸腔積液對診斷結核性胸膜炎的初步探討.中華結核和呼吸雜志,2014,37(5)：323-327.

[3] 張立華，靳文香，賈紅彥，等.T-SPOT與結核菌素試驗對結核病患者的臨床診斷價值.中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2012,6(14)：4107-4108.

[4] 中華醫(yī)學會結核病學分會.肺結核診斷和治療指南.中華結核和呼吸雜志,2001,24(2)：70-74.

[5] 中國防癆協(xié)會結核病臨床專業(yè)委員會.結核病臨床診治進展年度報告(2013年度).中國防癆雜志，2014,36(8)：714-740.

[6] 賈紅彥，潘麗萍，劉菲，等.結核分枝桿菌感染T細胞斑點試驗對淋巴結結核的輔助診斷價值研究. 中國防癆雜志，2014,36(6)：467-471.

[7] 范俊，秦世炳，賈紅彥，等.結核感染T細胞酶聯(lián)免疫斑點試驗與結核抗體檢測在骨關節(jié)結核輔助診斷中的價值. 中國防癆雜志，2014,36(10)：884-887.

[8] 楊新婷，楊揚，杜鳳嬌，等.肺結核患者全血γ干擾素釋放試驗影響因素的探討. 中國防癆雜志，2013,35(12)：1007-1012.

[9] 陳雪林，崔嘉，劉宇，等.兩種全血γ-干擾素釋放試驗試劑盒在結核病診斷中的比較研究.中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2013,7(24)：11380-11383.

[10] 李紅，唐神結，史祥，等.全血γ-干擾素釋放試驗對涂陰肺結核診斷價值的研究. 中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2012,6(16)：4894-4897.

(本文編輯：郭萌)

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.05.015

100095 北京老年醫(yī)院感染疾病科

陳雪林，Email：chenxuelin.1971@163.com

2014-11-02)