辛延樂 李艷花 張輝 楊興旺 楊春彥 尉杰忠 劉春云 肖保國 馬存根

Rho激酶抑制劑：治療神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的潛在藥物

辛延樂 李艷花 張輝 楊興旺 楊春彥 尉杰忠 劉春云 肖保國 馬存根

近10年來，由于神經(jīng)影像和分子生物學迅速發(fā)展，神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的診斷取得了長足進步。相比之下，其治療仍然舉步維艱。了解神經(jīng)變性的細胞和分子機制，尋找真實有效的干預靶點、提高疾病預防和治療效果是臨床神經(jīng)科學迫切需要解決的現(xiàn)實問題。近年來人們發(fā)現(xiàn)諸多神經(jīng)變性病呈現(xiàn)相似的病理和重疊的臨床表現(xiàn)，它們之間存在類似的細胞和分子機制，免疫炎性反應形成的微環(huán)境是其共同的細胞學通路，而其中Rho激酶(ROCK)的異常激活可能是其共同的分子機制之一。研究表明通過抑制ROCK的活性能夠減少免疫細胞的炎性反應、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)一氧化氮(NO)、白細胞介素1β (IL-1β )、白細胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)等炎性因子產(chǎn)生，改善炎性微環(huán)境保護神經(jīng)元，同時抑制ROCK活性還可促進神經(jīng)突觸再生和神經(jīng)干細胞動員分化。綜上，ROCK抑制劑(Rho kinase inhibitor，RKI)有可能成為神經(jīng)變性疾病的潛在藥物。本文就RKI 治療神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的潛在可能和相應機制進行簡要綜述。

Rho激酶抑制劑；神經(jīng)系統(tǒng)變性疾??；免疫炎性反應

神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病如阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)、帕金森病(Parkinson disease，PD)、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)和肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)等已成為嚴重危害人類健康的疾病。不同類型的神經(jīng)變性病變，除了受損部位和神經(jīng)元不同之外，在組織病理學檢查中，均可觀察到神經(jīng)細胞的染色變淡、萎縮，胞體表面不平，細胞核固縮或碎裂和胞質(zhì)內(nèi)虎斑溶解等組織病理學特征，臨床研究和動物實驗的證據(jù)發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)炎性反應與這些神經(jīng)變性病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)的免疫炎性反應可能是神經(jīng)變性的共同通道[1]。激活的小膠質(zhì)細胞、反應性星形膠質(zhì)細胞、損傷的血-腦脊液屏障(blood brain barrier，BCB)、入侵的T細胞以及過度產(chǎn)生的炎性反應介質(zhì)組成了神經(jīng)炎性反應微環(huán)境。大量研究表明，諸多CNS變性疾病均存在Rho激酶( ROCK)的異常激活，推測ROCK可從不同的層面影響疾病的發(fā)生和發(fā)展。ROCK可能參與免疫炎性反應，神經(jīng)突觸異常和神經(jīng)元變性，在神經(jīng)變性網(wǎng)絡中扮演軸心作用。因此，ROCK信號通路可能成為神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的靶標。

1 免疫炎性反應：神經(jīng)變性的共同通道

不同神經(jīng)變性疾病都有各自不同的誘發(fā)炎性反應的特異機制，如不溶性β淀粉樣肽(β-myloid peptide，Aβ)、α突觸核蛋白(α-synuclein)、突變型超氧化物歧化酶1(mutant superoxide dismutase 1，SOD1)等炎性反應誘發(fā)物的產(chǎn)生途徑和解剖位置決定了不同疾病的特異性。值得注意的是，在神經(jīng)變性中小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞被激活是炎性反應的共同現(xiàn)象。細胞因子〔如腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素6(IL-6)〕、炎性趨化因子、活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)和一氧化氮(NO)可能是各種神經(jīng)變性疾病中普遍存在的神經(jīng)毒性因子，它們對周圍神經(jīng)元的存亡起著決定性的作用。

1.1 免疫炎性反應與MS MS是自身性T細胞引起CNS炎性級聯(lián)反應導致的神經(jīng)組織損傷。Th1和Th17自身反應性T細胞可通過分泌IFN-γ和TNF-α激活小膠質(zhì)細胞和腦內(nèi)炎性反應形成MS斑塊，導致髓鞘病變伴軸突變性。如損傷和炎性反應是短暫，神經(jīng)元髓鞘可再生；若慢性炎性反應持續(xù)存在，將導致軸突變性和神經(jīng)元死亡。

1.2 免疫炎性反應與AD 盡管AD發(fā)病的分子基礎目前還未完全闡明，但由Aβ沉積引發(fā)的神經(jīng)免疫炎性反應在AD神經(jīng)變性過程中起著重要作用，體外研究和動物體內(nèi)試驗的研究結(jié)果均表明異常沉積的Aβ可能是AD中炎性反應的激發(fā)因子，Aβ過度激活小膠質(zhì)細胞，導致無法遏制的免疫炎性反應進行性損傷膽堿能神經(jīng)元，同時導致患者認知功能障礙不斷加重[2]。

1.3 免疫炎性反應與PD 研究表明免疫炎性反應與PD的病程發(fā)展密切相關(guān)。McGeer等[3]發(fā)現(xiàn)PD患者黑質(zhì)致密部損傷神經(jīng)元的周圍存在激活的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞。此外，用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6四氫吡啶(1-methyl-4-henyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)誘導的PD動物模型中，除了黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的病變以外，受損神經(jīng)元周圍還存在大量激活的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞[4-6]。

1.4 免疫炎性反應與ALS ALS為一種嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，以脊髓、腦干、皮層的運動神經(jīng)元選擇性變性死亡為特點。近年來炎性反應機制在ALS發(fā)病中的作用逐漸得到關(guān)注[7]，該病的炎性反應是以星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞增生和大量聚集為主要特征。有研究者利用PET技術(shù)證實了在ALS患者的運動皮層、前額背外側(cè)皮層、丘腦、腦橋均有激活的小膠質(zhì)細胞分布，而健康對照組未觀察到上述現(xiàn)象。

2 ROCK抑制劑：治療神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的潛在藥物

目前，臨床使用的藥物多數(shù)只能緩解神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病癥狀，不能影響疾病的進展。因此，了解神經(jīng)變性疾病的細胞和分子機制，從而尋找真實有效的干預靶點，提高疾病的預防和治療效果是臨床神經(jīng)科學迫切需要解決的現(xiàn)實問題。研究表明ROCK抑制劑(Rho kinase inhibitor，RKI)具備治療神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的諸多細胞和分子基礎。首先，RKI具有明顯的抑制免疫炎性反應的作用，可通過3個層面達到抗炎效果。(1)RKI能夠抑制小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生NO、IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性分子，改善炎性微環(huán)境從而保護神經(jīng)元[8]。(2)在MS動物模型實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)和PD模型中，小膠質(zhì)細胞激活表現(xiàn)為M1炎性細胞表型，而RKI可部分將M1炎性細胞轉(zhuǎn)化為M2抗炎小膠質(zhì)細胞[9]。(3)RKI可完善BCB或血脊髓屏障，阻止外周免疫炎性細胞浸潤，抑制外周免疫炎性細胞的黏附和移行，減少由此引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應。其次，RKI具備突觸再生的能力和內(nèi)源性神經(jīng)干細胞動員的潛能。因此，RKI有可能成為治療神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的理想藥物。鹽酸法舒地爾(Fasudil)是目前臨床惟一使用的RKI，1995年作為治療蛛網(wǎng)膜下腔出血藥物在日本上市。

2.1 RKI與MS 在慢性EAE模型，ROCK 早期即可激活并迅速達到高峰，持續(xù)一段時間后有所下降。ROCK信號途徑參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞屏障功能和跨內(nèi)皮細胞淋巴細胞遷徙，ROCK 激活可損害BCB和血脊髓屏障，增加外周反應性T細胞的浸潤，促進和放大腦內(nèi)的免疫炎性反應微環(huán)境，有助于髓鞘脫失和軸索破壞。RKI 可明顯改善EAE臨床癥狀和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性反應及髓鞘脫失，顯示了良好的治療效果[10]。Feske等[11]指出，法舒地爾可以促進EAE小鼠神經(jīng)軸突再生，減低血管通透性，抑制炎性細胞聚集和炎性因子的釋放。本文作者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射法舒地爾可明顯改善EAE小鼠臨床癥狀，并可下調(diào)NF-κB[12]和抑制occludin的表達[13]，減少炎性浸潤和髓鞘脫失，調(diào)節(jié)炎性M1小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞轉(zhuǎn)化為抗炎M2細胞，從而減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性微環(huán)境。

2.2 RKI與AD AD模型腦內(nèi)ROCK異常激活，推測可能參與AD的發(fā)生和發(fā)展。ROCK可以調(diào)節(jié)A β1-42的產(chǎn)生，抑制ROCK可減少Aβ1-42的產(chǎn)生。ROCK抑制劑除了被證明通過降低Aβ1-42水平減輕毒性而減輕變性外，還能通過β-分泌酶通路增加外功能區(qū)脫落[14]。另外，突觸功能異常和突觸丟失也被廣泛認為是AD的細胞機制，其神經(jīng)元突觸較正常人可減少36%～46%，并與臨床表現(xiàn)相關(guān)，但AD突觸結(jié)構(gòu)和功能異常的機制仍不清楚。ROCK激活可引起Aβ增加，從而使CRMP-2磷酸化而阻礙微管蛋白組裝，導致神經(jīng)突觸抑制[15]。有研究發(fā)現(xiàn)抑制ROCK可增加海馬錐體神經(jīng)元突觸密度和長度，改善空間學習和工作記憶[16]。法舒地爾治療可明顯減輕大鼠的空間學習和記憶功能損害，病理發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元受損較輕，并且IL-1β、TNF-α及NF-κB含量也明顯下降。其原因可能是法舒地爾通過抑制炎性反應使Aβ1-42誘導引起的海馬神經(jīng)元變性程度減輕[17]。綜上，Rho/ROCK信號通路可能參與免疫炎性反應，神經(jīng)突觸異常和神經(jīng)元變性[18]，RKI可成為AD防治的靶標。

2.3 RKI與PD Villar-Cheda等[19]在PD小鼠模型中發(fā)現(xiàn)ROCK激活參與多巴胺神經(jīng)元死亡。另有研究者發(fā)現(xiàn)α-synuclein可導致神經(jīng)元軸突串珠樣改變，而Aβ還可以促進α-synuclein誘導神經(jīng)突觸損害，提示了AD、PD和ROCK之間的潛在聯(lián)系[20]。RKI 可減少神經(jīng)元α-synuclein表達，增強PD模型多巴胺神經(jīng)元的存活并減輕神經(jīng)軸突損失，具有一定的干預和治療PD的作用。在MPTP誘導的PD模型小鼠體內(nèi)給藥實驗中，法舒地爾一方面可使PD模型小鼠的臨床癥狀得到明顯改善，還可促進小鼠體內(nèi)DA能神經(jīng)元的存活、抑制軸突損害等進而起到對神經(jīng)元的保護作用[21]。Villar-Cheda等[19]應用C57BL-6小鼠成功建立MPTP誘導的PD模型，給予ROCK抑制劑Y-27632藥物治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn) PD模型黑質(zhì)區(qū)域RhoA的表達和ROCK ⅡmRNA含量明顯增多，并且ROCK活性也明顯增強，證實了黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的變性中存在ROCK信號通路的異常激活。該研究還發(fā)現(xiàn)Y-27632既能抑制小膠質(zhì)細胞的活性，又能使DA能神經(jīng)元的死亡速度減慢。

綜上可見，變性疾病中，激活的小膠質(zhì)細胞、反應性星形膠質(zhì)細胞、損傷的BCB、入侵的T細胞以及過度產(chǎn)生的炎性介質(zhì)組成了神經(jīng)炎性反應，危害神經(jīng)元的存活。盡管炎性反應并不一定是神經(jīng)變性疾病的始發(fā)因素，但是持續(xù)的炎性反應會導致疾病的進行性加重，使炎性反應與神經(jīng)元病變之間構(gòu)成惡性循環(huán)，最終導致更多神經(jīng)元的變性死亡。目前臨床上的藥物只能緩解癥狀，但不能影響疾病的進展。為了更有效地治療神經(jīng)變性疾病，阻斷神經(jīng)元繼續(xù)變性死亡，控制疾病的發(fā)展，需要有新的治療策略及藥物，以限制致炎因子和氧化應激分子的過度產(chǎn)生，完善BCB或血脊髓屏障，阻止外周免疫炎性細胞浸潤，在改善炎性微環(huán)境的同時促進和修復受損的神經(jīng)組織和細胞。 RKI是目前已知兼?zhèn)渖鲜鰸撃芩幬?，并且在動物實驗上呈現(xiàn)了良好的治療效果，有望成為治療人類神經(jīng)變性病的一個有效靶點。

[1]Glass CK，Saijo K，Winner B，et al. Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration[J]. Cell，2010，140(6): 918-934.

天津富水軟土地層超大矩形斷面頂管施工技術(shù)對策與實踐……………………………………………………… 林楓（10-215）

[2]Gao HM，Hong JS. Why neurodegenerative diseases are progressive：uncontrolled inflammation drives disease progression[J]. Trends Immuno1，2008，29：357-365.

[3]McGeer PL, Itagaki S, Boyes BE, et al. Reactive microglia are positive for HLA-DR in the substantia nigra of Parkinson’s and Alzheimer’s disease brains[J]. Neurology. 1988, 38(8):1285-1291.

[4]Maezawa I，Zimin PI，Wulff H， et al. Amyloid-beta protein oligomer at low nanomolar concentrations activates microglia and induces microglial neurotoxicity[J]. J Biol Chem，2011，286(5: 3693:3706.

[5]Chung YC，Ko HW，Bok E，et al. The role of neuroinflammation on the pathogenesis of Parkinson’s disease[J]. BMB Rep，2010，43(4): 225-232.

[6]Gao HM，Zhou H，Zhang F，et al. HMGB1 Acts on microglia Mac1 to mediate chronic neuroinflammation that drives progressive neurodegeneration[J]. J Neurosci，2011，31(3) ：1081-1092.

[7]Monk PN, Shaw PJ. A LS: life and death in a bad neighborhood[J]. Nat Med, 2006, 12(8): 885-887.

[9]Liu CY, Li YH, Yu JZ, et al. Targeting the shift from M1 to M2 macrophages in experimental autoimmune encephalomyelitis mice treated with Fasudil[J]. PLoS One, 2013, 8:e54841.

[10]Hou SW, Liu CY, Li YH， et al. Fasudil ameliorates disease progression in experimental autoimmune encephalomyelitis, acting possibly through antiinflammatory effect[J]. CNS Neurosci Ther, 2012,18:909-917.

[11]Feske SK，Sorond FA，Henderson GV，et al．Increased leukocyte ROCK activity inpatients after acute ischemic stroke[J]. Brain Res，2009，1257：89-93．

[12]侯紹蔚，劉岳婷，郭敏芳，等．鹽酸法舒地爾治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎的潛能與抗炎作用[J]．中國臨床神經(jīng)科學，2012，20(2)：126-134．

[13]劉岳婷，侯紹蔚，劉春云，等．法舒地爾通過誘導EAE小鼠Occludin表達抑制其炎性細胞浸潤[J]．中國神經(jīng)免疫學和神經(jīng)病學雜志，2012，19(3): 206-210．

[14]Bai F，Zhang Z，Watson DR，et al. Abnormal functional connectivity of hippocampus during episodic memory retrieval processing network in amnestic mild cognitive impairment[J]. Biol Psychiatry 2009，65：951-958.

[15]Petratos S，Li QX，George AJ， et al. The beta-amyloid protein of Alzheimer’s disease increases neuronal CRMP-2 phosphorylation by a Rho-GTP mechanism[J]. Brain, 2008，131：90-108.

[16]Couch BA，DeMarco GJ，Gourley SL，et al. Increased dendrite branching in AbetaPP/PS1 mice and elongation of dendritearbors by fasudil administration[J]. J Alzheimers Dis, 2010，20：1003-1008.

[17]Song Y， Chen X，Wang LY，et al. Rho kinase inhibitor fasudil protects against β-amyloid-induced hippocampal neurodegeneration in rats[J]. CNS Neurosci Ther，2013，19(8)：603-610.

[18]Mueller BK, Mack H, Teusch N，et al. Rho kinase，a promising drug target for neurological disorders[J]. Nat Rev Drug Discov, 2005，4：387-398.

[19]Villar-Cheda B，Dominguez-Meijide A，Joglar B，et al. Involvement of microglial RhoA/Rho-Kinase pathway activation in the dopaminergic neuron death. Role of angiotensin via angiotensin type 1 receptors[J]. Neurobiol Dis, 2012，47：268-279.

[20]Bate C, Gentleman S, Williams A.α-synuclein induced synapse damage is enhanced by amyloid-β1-42[J]. Mol Neurodegener, 2010, 5:55.

[21]T?nges L，F(xiàn)rank T，Tatenhorst L，et al. Inhibition of Rho kinase enhances survival of dopaminergic neurons and attenuates axonal loss in a mouse model of Parkinson’s disease[J]. Brain，2012，135(Pt11)：3355-3370.

(本文編輯：鄒晨雙)

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.04.015

國家自然科學基金2012年面上項目(81272163)；山西省國際科技合作項目(2013081058)；山西省回國留學人員重點科研資助項目(2014-重點7)；山西中醫(yī)學院“2011”培育計劃項目(2011PY-1)；山西省自然科學基金項目(2008011082-1)

030001 山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院(辛延樂、張輝、馬存根)；037009 山西大同大學腦科學研究所(辛延樂、李艷花、張輝、楊興旺、 楊春彥、 尉杰忠、劉春云、馬存根)；030024 山西中醫(yī)學院“2011”協(xié)同創(chuàng)新中心/國家衛(wèi)生部臨床重點?？?楊興旺、楊春彥、馬存根)；200025 復旦大學華山醫(yī)院神經(jīng)病學研究所(肖保國)

馬存根，Email：macungen2001@163.com

Q781；R741.05

A

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2014-10-08)