王健 王玉潔 辛岳 姜新

pEGFP-N1-APOE ε2重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

王健 王玉潔 辛岳 姜新

目的 構(gòu)建pEGFP-N1-APOEε2真核表達(dá)重組質(zhì)粒。方法 應(yīng)用基因定點(diǎn)突變手段，根據(jù)載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因cDNA克隆基因序列和表達(dá)載體增強(qiáng)綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體(pEGFP-N1)質(zhì)粒上的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，對(duì)質(zhì)粒APOE基因cDNA克隆(pMD18-T-APOE3)進(jìn)行基因定點(diǎn)突變，得到含有APOE2基因的目的片段，將此目的片段插入載體啟動(dòng)子下游，與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的基因融合。重組質(zhì)粒經(jīng)菌液PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和測序，鑒定目的基因是否成功插入pEGFP-N1質(zhì)粒。結(jié)果 對(duì)所得pEGFP-N1-APOE ε2質(zhì)粒插入部分測序結(jié)果顯示，pEGFP-N1-APOE ε2質(zhì)粒的方向及序列正確，閱讀框正確無誤，表明APOEε2基因定點(diǎn)突變正確，重組pEGFP-N1-APOE ε2質(zhì)粒構(gòu)建成功。結(jié)論 成功構(gòu)建了pEGFP-N1-APOE ε2真核表達(dá)重組質(zhì)粒。

APOE ε2基因；真核表達(dá)質(zhì)粒；基因重組；綠色熒光蛋白

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是以癡呆為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性病，主要病理改變是以淀粉樣蛋白為核心的老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)沉積，目前AD病因不明，缺乏有效治療方法。1991年，Pericak-Vance等發(fā)現(xiàn)位于第19號(hào)染色體上的載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因與AD有關(guān)[1]，之后發(fā)現(xiàn)APOE 基因多態(tài)性(ε2、ε3和ε4)與AD關(guān)系非常密切[2]。ε4等位基因型是晚發(fā)性AD遺傳高危因素[3]，攜帶ε4等位基因者平均AD發(fā)病年齡低，攜帶ε2等位基因者平均AD發(fā)病年齡較高[4]。AD患病風(fēng)險(xiǎn)與這些等位基因疊加有關(guān)，即ε4/ε4基因型患AD的風(fēng)險(xiǎn)高于ε3/ε4 或ε2/ε4基因型，ε2/ε2基因型比只有一個(gè)ε2等位基因的基因型更不易罹患AD。上述結(jié)果在大量研究和多個(gè)種族群體中得到重復(fù)驗(yàn)證[5]，其他研究表明ε2基因具有對(duì)抗AD的作用[6-7]。另有試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，海馬CA3區(qū)內(nèi)注射慢病毒為載體的人類ε2基因5周后，過表達(dá)人類淀粉樣蛋白前體鼠(即PDAPP轉(zhuǎn)基因小鼠)淀粉樣蛋白沉積減少30%～50%[8]?；诖?，本研究旨在構(gòu)建以增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)為載體的 APOEε2質(zhì)粒，期望為AD基因治療研究提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 質(zhì)粒APOE基因cDNA克隆(pMD18-T-APOE3)購于北京義翹神州生物技術(shù)有限公司；PrimeSTAR?HS DNA Polymerase(具有高保真性和高擴(kuò)增效率的PCR的DNA聚合酶)、 TaKaRa MiniBEST瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒3.0、DL2 000 DNA Marker、In-Fusion?高品質(zhì)基因克隆套件(In-Fusion?HD Cloning Kit)、Supercoiled DNA Ladder Marker均購于寶生物工程大連有限公司。PCR擴(kuò)增儀TaKaRa Thermal Cycler Dice TP600(TaKaRa公司)；核酸電泳儀Mupid(ADVANCE-BIO Co.,Ltd)；電泳成像裝置ImageMaster?VDS(Pharmacia Biotech)等。PCR引物由寶生物工程大連有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)所購APOE基因cDNA克隆基因序列(共含有901 bp)，將目的基因中的第526 bp的堿基C突變?yōu)門，3′端去TGA終止子(以ATG為起始)，合成下列引物。包括：F01：TCTCGAGCTCAAGCTTATGAAGGTTC-TGTGGGCTGCG；F02：CTGCAGAAGTGCCTGGCAGTGTACC；R01：ACTGCCAGGCACTTCTGCAGGTC；R04：GGCGACCGGTGGATCCCGGTGATTGTCGC。

1.2.2 目的片段制作：(1)PCR擴(kuò)增：使用PrimeSTAR?HS DNA Polymerase，對(duì)質(zhì)粒pMD18-T-APOE3進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：pMD18-T-APOE3(10 ng/μL),引物F01/F02(10 pmol/μL)，引物R01/R04(10 pmol/μL)各1 μL；dNTP Mixture(各2.5 mmol)4 μL；5×PrimeSTAR Buffer(Mg2+plus)10 μL；PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5 U/μL)0.5 μL，加dH2O至50 μL。反應(yīng)條件：98℃變性10 s、60℃復(fù)性10 s、72℃延伸30 s，循環(huán)30次，最后72℃延伸10 min，于4℃保存。將引物F01/R01、F02/R04的擴(kuò)增產(chǎn)物分別命名為PCR產(chǎn)物Ⅰ、PCR產(chǎn)物Ⅱ，取5 μL進(jìn)行1%(質(zhì)量濃度)瓊脂糖凝膠電泳分析。APOE 基因cDNA克隆基因全長954 bp，其第526 bp的堿基C突變?yōu)門，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，PCR產(chǎn)物Ⅰ大小應(yīng)略大于526 bp，PCR產(chǎn)物Ⅱ大小應(yīng)略大于428 bp。(2)PCR產(chǎn)物純化：對(duì)上述PCR產(chǎn)物使用TaKaRa MiniBEST瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒3.0進(jìn)行切膠回收后，分別命名為InsertⅠ、InsertⅡ，回收產(chǎn)物對(duì)應(yīng)上述PCR產(chǎn)物Ⅰ、PCR產(chǎn)物Ⅱ。

1.2.3 載體制作：(1)將質(zhì)粒pEGFP-N1，使用Hind Ⅲ/BamHⅠ進(jìn)行酶切。pEGFP-N1(200 ng/μL)5 μL，10×Buffer 5 μL，Hind Ⅲ(10 U/μL) 1 μL，BamHⅠ(10 U/μL)1 μL，加dH2O至50 μL。反應(yīng)條件為37℃溫育1 h。取上述酶切反應(yīng)液5 μL 進(jìn)行1%(質(zhì)量濃度) 瓊脂糖凝膠電泳。pEGFP-N1載體的大小為4733 bp，使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0切膠回收電泳條帶中約4.7 kb的DNA片段，將其命名為Vector。

1.2.4 融合、轉(zhuǎn)化、陽性克隆篩選：使用In-Fusion?高品質(zhì)基因克隆套件，將InsertⅠ、InsertⅡ和Vector載體連接，反應(yīng)體系：Vector(約70 ng/μL)2 μL，InsertⅠ(約50 ng/μL)1 μL，InsertⅡ(約50 ng/μL)1 μL，5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2 μL，加dH2O至10 μL。反應(yīng)條件：50℃15 min。轉(zhuǎn)化后取5 μL 進(jìn)行1%(質(zhì)量濃度)瓊脂糖凝膠電泳。pEGFP-N1-APOEε2質(zhì)粒大小約為5.7 kb，根據(jù)Supercoiled DNA Ladder Marker對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。

取上述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物2.5 μL熱轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌(E.coliCompetentCell)JM109中，涂布平板，37℃過夜培養(yǎng)。挑選陽性菌落植菌，提取質(zhì)粒作為pEGFP-N1-APOE ε2目標(biāo)質(zhì)粒，并送寶生物工程大連有限公司對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行測序。根據(jù)寶生物工程大連有限公司測序結(jié)果與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)DNA序列進(jìn)行對(duì)比，以證明pEGFP-N1質(zhì)粒中插入的901 bp基因片段為一開放閱讀框架，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中DNA序列是由APOE 3以及本實(shí)驗(yàn)所選擇的突變位點(diǎn)得來的，如果測序結(jié)果和本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)序列一致，且方向正確，則表明載體構(gòu)建成功。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 根據(jù)所購APOE基因cDNA克隆基因提供的序列，將目的基因中的第526 bp作為突變位點(diǎn)，進(jìn)行 PCR 產(chǎn)物擴(kuò)增后，經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，在500 bp上方和下方出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶(圖1)，PCR產(chǎn)物Ⅰ所在位置在500 bp到750 bp之間，PCR產(chǎn)物Ⅱ大小在500 bp略下方，該兩種產(chǎn)物長度符合實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)期。

M1：DL2000 DNA Marker；1：PCR產(chǎn)物Ⅰ；2：PCR產(chǎn)物Ⅱ

圖1 PCR產(chǎn)物Ⅰ、Ⅱ瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2 載體制作結(jié)果 使用Hind Ⅲ/BamHⅠ進(jìn)行酶切后，pEGFP-N1-Hind Ⅲ/BamHⅠ質(zhì)粒大小約為4.7 kb(圖2)，符合實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)期，對(duì)其進(jìn)行回收，即Vector。

M2：λ-Hind Ⅲ digest；1：pEGFP-N1-plasmid；2：pEGFP-N1-Hind Ⅲ/BamHⅠ

圖2 pEGFP-N1質(zhì)粒酶切液瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.3 目的基因與載體的連接 結(jié)果見圖3。 pEGFP-N1載體本身大小約為4.7 kb，APOE 基因cDNA克隆片段約為1 kb，APOE ε2基因克隆到pEGFP-N1 載體上所得到pEGFP-N1-APOE ε2質(zhì)粒大小約為5.7 kb，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果符合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)期。

M：Supercoiled DNA Ladder Marker；1：pEGFP-N1-APOE ε2；2：pEGFP-N1

圖3 pEGFP-N1-APOE ε2質(zhì)粒和pEGFP-N1質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.4 測序鑒定結(jié)果 所得pEGFP-N1-APOE ε2質(zhì)粒插入部分測序結(jié)果顯示，pEGFP-N1-APOE ε2質(zhì)粒的方向及序列正確，閱讀框正確無誤。以上結(jié)果表明APOE ε2基因定點(diǎn)突變成功，表明重組pEGFP-N1-APOE ε2質(zhì)粒構(gòu)建成功。

3 討論

AD表現(xiàn)為進(jìn)行性癡呆，是老年人致殘重要原因之一[9]。流行病學(xué)研究顯示，目前全球AD患者高達(dá)2 400萬，預(yù)計(jì)2040年始患者總數(shù)將每20年增長1倍[10]。AD發(fā)病機(jī)制與APOE基因多態(tài)性密切相關(guān)[2]，其中APOEε4等位基因型是晚發(fā)性AD遺傳高危因素[3]，APOEε2基因則有延緩AD發(fā)生的作用[6-7]。在APOE基因型中，APOEε3占78%，APOEε4占15%，ε2基因僅占7%[11]；三者分別編碼APOE蛋白E2、E3和E4。目前人類能夠自然得到的APOE基因型僅有ε3，它與APOEε2的區(qū)別在于第526位堿基不同，APOEε3為C，APOEε2為T。本研究通過基因定點(diǎn)突變技術(shù)將APOEε3的526位C突變?yōu)門，即獲得了APOEε2；通過酶切和融合，把目的基因APOEε2連接到pEGFP-N1上。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)具有獨(dú)特發(fā)光機(jī)制，可作為蛋白質(zhì)標(biāo)簽，即利用DNA重組技術(shù)，將目的基因與GFP基因，構(gòu)成融合基因，轉(zhuǎn)染至合適的細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，然后借助熒光顯微鏡可對(duì)標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)活體觀察。GFP相對(duì)較小，只有238個(gè)氨基酸，與其他蛋白融合后不影響自身的發(fā)光功能和宿主細(xì)胞功能。pEGFP為GFP 突變類型，產(chǎn)生的熒光較突變前強(qiáng)35倍，明顯提高了其“標(biāo)簽”的敏感度。pEGFP其N及C端均可融合其他蛋白，并不影響蛋白的發(fā)光特性。pEGFP-N1載體含高效啟動(dòng)子，復(fù)制能力很強(qiáng)，可使目的基因穩(wěn)定表達(dá)；而且pEGFP-N1載體具有目的基因插入的多克隆位點(diǎn)。在熒光顯微鏡下，用波長約490 nm的紫外線激發(fā)后，即可直接觀察到綠色熒光而蛋白本身性質(zhì)穩(wěn)定。既往有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了GFP基因小鼠可用于研究神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)生理，GFP在活體和離體神經(jīng)元中都可以表達(dá)，在胚胎腦和成熟腦中均表達(dá)，而且GFP的表達(dá)對(duì)神經(jīng)元生理沒有明顯影響；表達(dá)GFP的神經(jīng)元形態(tài)、細(xì)胞功能和細(xì)胞生存與非表達(dá)GFP神經(jīng)元相同[12]。研究表明含有終止密碼子、編碼EGFP的cDNA插入緊鄰翻譯起始部位的鼠APOE基因位點(diǎn)后，建立了報(bào)告基因鼠EGFPapoE ，此時(shí)EGFP就成為APOE體內(nèi)表達(dá)的實(shí)時(shí)定位標(biāo)志物，而且余下的等位基因足以維持正常細(xì)胞功能。報(bào)告基因鼠EGFPapoE對(duì)于研究APOE中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)的調(diào)節(jié)、深入研究APOEε4相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病多種機(jī)制很有幫助[13]。

本研究將突變獲得的APOEε2基因片段連接到pEGFP-N1載體上，構(gòu)建了重組的pEGFP-N1-APOEε2質(zhì)粒，并經(jīng)測序鑒定證實(shí)pEGFP-N1-APOE ε2真核表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。通過不同途徑將pEGFP-N1-APOE ε2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至AD模型腦組織中，觀察重組質(zhì)粒的熒光和ApoE2蛋白表達(dá)情況，以及ApoE2蛋白對(duì)AD模型腦組織老年斑等病理變化的影響，對(duì)AD基因治療研究提供試驗(yàn)依據(jù)。目前，國內(nèi)已有人成功構(gòu)建了人AChR-Fc融合蛋白真核表達(dá)載體[14]，如果同時(shí)構(gòu)建pEGFP-N1-APOEε4質(zhì)粒，并與pEGFP-N1-APOEε2質(zhì)粒對(duì)比研究，可能對(duì)于AD發(fā)病機(jī)制和治療的探討更有幫助。

[1]Pericak-Vance MA, Bebout JL, Gaskell PC, et al. Linkage studies in familial Alzheimer disease: evidence for chromosome 19 linkage[J]. Am J Hum Genet, 1991,48:1034-1050.

[2]Strittmatter WJ, Saunders AM, Schmechel D, et al. Apolipoprotein-E: high-avidity binding to beta-amyloid and increased frequency of type 4 allele in late-onset familial Alzheimer disease[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90: 1977-1981.

[3]Mahley RW, Rall SC Jr. Is epsilon4 the ancestral human apoE allele?[J]. Neurobiol Aging, 1999,20:429-430.

[4]Corder EH, Saunders AM, Strittmatter WJ, et al. Gene dose of apolipoprotein-E type-4 allele and the risk of Alzheimer’s disease in late onset families[J]. Science, 1993, 261: 921-923.

[5]Farrer LA, Cupples LA, Haines JL, et al. Effects of age, sex, and ethnicity on the association between apolipoprotein E genotype and Alzheimer disease: a meta analysis[J]. JAMA, 1997, 278: 1349-1356.

[6]Chartier-Harlin MC, Parfitt M, Legrain S, et al. Apolipoprotein Eε4 allele as a major risk factor for sporadic early and late-onset forms of Alzheimer’s disease: analysis of the 19q13.2 chromosomal region[J]. Hum Mol Genet, 1994,3: 569-574.

[7]Corder EH, Saunders AM, Risch NJ, et al. Protective effect of apolipoprotein E type 2 allele for late onset Alzheimer disease[J]. Nature Genet, 1994, 7:180-184.

[8]Dodart JC, Marr RA, Koistinaho M, et al. Gene delivery of human apolipoprotein E alters brain Abeta burden in a mouse model of Alzheimer’s disease[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2005, 102(4):1211-1216.

[9]Alagiakrishnan K, Gill SS, Fagarasanu A, et al. Genetics and epigenetics of Alzheimer’s disease[J]. Postgrad Med J, 2012, 88: 522-529.

[10]Reitz C, Brayne C, Mayeux R. Epidemiology of Alzheimer disease[J].Nat Rev Neurology, 2011,7(3):137-152.

[11]Strittmatter WJ, Roses AD. Apolipoprotein E and Alzheimer disease[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995, 92(11): 4725-4727.

[12]van den Pol AN, Ghosh PK.Selective neuronal expression of green fluorescent protein with cytomegalovirus promoter reveals entire neuronal arbor in transgenic mice[J]. J Neurosci, 1998, 18(24):10640-10651.

[13]Xu Q, Bernardo A, Walker D, et al. Profile and regulation of apolipoprotein E (ApoE) expression in the CNS in mice with targeting of green fluorescent protein gene to the ApoE locus[J]. J Neurosci, 2006, 26(19): 4985-4994.

[14]常婷,林宏,劉煜，等.人AChR-Fc融合蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)[J].中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志, 2011,18(4): 276-279.

(本文編輯：鄒晨雙)

Construction and verification of pEGFP-N1-APOE ε2 recombinant plasmid

WANGJian,WANGYujie*,XINYue,JIANGXin.

*DepartmentofNeurologyand,LiaoningProvincialHospital,ShenyangLiaoning110016,China

WANG Yujie, Email: wangyujie196508@163.com

Objective To construct enhanced green fluorescent protein(EGFP) labled eukaryotic expression recombinant plasmid of APOE ε2 gene. Methods According to the sequence of cDNA cloning gene of APOE gene and the multiple clone site of the expression vector pEGFP-N1 plasmid, two specific pairs of primers were desinged and synthesized by site-directed mutation. PCR amplification was carried out on the pMD18-T-APOE3, and an target fragment was acquired. The target fragment was inserted into the carrier promoter downstream and was fused into EGFP gene fusion. The recombinant plasmid was verified by PCR of the bacterium liquid, restriction enzyme digestion and gene sequencing. Results The inserted part of pEGFP-N1-APOE ε2 plasmid showed that the direction and sequence pEGFP-N1-APOE ε2 plasmid and the reading frame were correct. The results showed that site-directed mutagenesis of APOE ε2 was correct and recombinant pEGFP-N1-ApoE ε2 plasmid was successful.Conclusions The pEGFP-N1-APOE ε2 eukaryotic expression recombinant plasmid was successfully constructed

APOE ε2 gene; eukaryotic expression plasmid; genetic recombination;green fluorescent protein

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.04.003

遼寧省自然科學(xué)基金計(jì)劃(201102105)

110016 遼寧省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

王玉潔，Email：wangyujie196508@163.com

R743.9

A

1006-2963 (2015)04-0237-04

2014-01-23)