姜潔璇，孫磊，金鎮(zhèn)，息小雪，鄭陽，張璇，馮沖

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽110004）

·論著·

性激素結(jié)合球蛋白和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白在妊娠期糖尿病胎盤組織中的表達及相關(guān)性

姜潔璇，孫磊，金鎮(zhèn)，息小雪，鄭陽，張璇，馮沖

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽110004）

目的 探討妊娠期糖尿?。℅DM）胎盤組織細胞中性激素結(jié)合球蛋白（SHBG）和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（GLUT1、GLUT3、GLUT4）的表達及相關(guān)性。方法應(yīng)用免疫細胞化學(xué)染色法檢測SHBG與GLUT1、GLUT3、GLUT4在30例GDM孕婦和30例正常孕婦胎盤組織中的表達情況。結(jié)果在GDM孕婦胎盤組織中，SHBG、GLUT1、GLUT3、GLUT4陽性細胞的平均光密度值分別為0.401 6±0.014 8，0.405 8±0.012 3，0.402 0±0.012 1，0.391 3±0.008 4。在正常孕婦胎盤組織中，陽性細胞的平均光密度值分別為0.414 2±0.011 5，0.427 0±0.029 4，0.418 0±0.008 7，0.402 9±0.095 9。比較SHBG與GLUT1、GLUT3、GLUT4在GDM孕婦和正常孕婦胎盤組織中的表達水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示：SHBG和GLUT4在胎盤組織中的表達量呈正相關(guān)（R2=0.410 4，P＜0.05）。結(jié)論GLUT1是胎盤中最主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運載體，可能在母嬰間葡萄糖轉(zhuǎn)運中發(fā)揮主要的作用。GLUT4在胎盤組織表達較少，卻受SHBG表達的影響。

性激素結(jié)合球蛋白；葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白類；胎盤；妊娠期糖尿病

最近的研究表明，性激素結(jié)合球蛋白（sex hormone binding globulin，SHBG）在胎盤等組織中有不同程度的表達。SHBG除能特異性的結(jié)合并轉(zhuǎn)運性激素外，還具有介導(dǎo)激素信號傳導(dǎo)和類激素樣作用。而且，SHBG是糖尿病的危險因素之一，在妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）的發(fā)病中起重要的調(diào)節(jié)作用［1～3］。葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（glucose transporter，GLUT）是一個蛋白家族，包括多種蛋白，在體內(nèi)的分布以及與葡萄糖分子的親和力差異顯著。研究證明，在人類胎盤中存在GLUT1、GLUT3和GLUT4［4］。GLUT4是胰島素信號傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵分子，在胰島素作用下，主要發(fā)揮攝取葡萄糖的作用，其蛋白表達下調(diào)可導(dǎo)致對胰島素的敏感性降低，產(chǎn)生胰島素抵抗［5］。因此，本研究擬采用免疫細胞化學(xué)染色方法檢測GDM胎盤組織中SHBG、GLUT1、GLUT3和GLUT4的表達及其相關(guān)性，研究GDM時SHBG對胰島素轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，旨在進一步探討其在GDM發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：選取2012年2月至2013年2月期間，在中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院分娩的GDM孕婦30例，無其他產(chǎn)科合并癥和并發(fā)癥。根據(jù)2010年國際糖尿病和妊娠研究組（International Association of Diabetes and Pregnancy Study Group，IADPSG）推薦的GDM診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］，于妊娠24～28周行75 g口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT），空腹、服糖后1 h和2 h的血糖值分別為5.1 mmol/L、10.0 mmol/L、8.5 mmol/L，其中任一項達到或超過上述血糖值即診斷為GDM。選擇同期糖代謝正常且無其他產(chǎn)科合并癥和并發(fā)癥的孕婦30例作為對照組。本研究由遼寧省衛(wèi)生廳倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象均簽署了知情同意書。

1.1.2 主要試劑：兔抗人SHBG和GLUT1、GLUT3、GLUT4單克隆抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；免疫組化染色鏈霉親和素—生物素—過氧化物酶復(fù)合物（strept avidin-biotin complex，SABC）試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫細胞化學(xué)染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化后放入1%H2O2溫箱37℃30 min。加入枸櫞酸抗原修復(fù)液微波修復(fù)15 min，自然冷卻至室溫。于37℃溫箱血清封閉30 min。加入第一抗體（兔抗人SHBG/GLUT1/GLUT3/GLUT4多克隆抗體，1∶150/ 1∶200/1∶200/1∶50）濕盒孵育，4℃冰箱過夜。滴加第二抗體（羊抗兔）37℃30 min。滴加試劑辣根酶，37℃20 min。DAB溶液顯色。鏡下觀察著色后立即用自來水終止顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。PBS替代第一抗體作陰性對照。結(jié)果判定：SHBG、GLUT1、GLUT3、GLUT4為細胞質(zhì)著色，染色為淡黃色、黃色、棕黃色、棕褐色為陽性結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 2組孕婦一般臨床資料比較

比較2組孕婦年齡、孕周、收縮壓（systolic pressure，SBP）、舒張壓（diastolic pressure，DBP），差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 GDM組與對照組一般臨床資料比較Tab.1 General clinical data of GDM group and control group

GDM，gestational diabetes mellitus；SBP，systolic blood pressure；DBP，diastolic blood pressure.

Group n Age（year）Gestational age（week）SBP（mmHg）DBP（mmHg）GDM 30 31.27±4.250 38.76±1.061 121.40±13.000 77.27±11.191 Control 30 29.90±4.649 38.96±0.753 119.70±10.538 73.83±7.534

2.2 SHBG在GDM組和對照組胎盤組織中的表達如圖1所示：SHBG陽性細胞表達分布于整個胎盤合體滋養(yǎng)細胞，主要位于細胞膜和細胞質(zhì)，微絨毛側(cè)著色深，表達強；基底膜側(cè)著色不甚均勻，表達弱。對照組平均光密度值（0.414 2±0.011 5）高于GDM組（0.401 6±0.014 8），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t= 3.582，P＜0.05）。

2.3 GLUT1在GDM組和對照組胎盤組織中的表達

如圖2所示：GLUT1陽性細胞表達分布于胎盤細胞滋養(yǎng)細胞，合體滋養(yǎng)細胞和胎盤血管內(nèi)皮細胞，主要位于細胞膜和細胞質(zhì)，微絨毛側(cè)著色深，表達強，基底膜側(cè)著色均勻，表達弱。對照組平均光密度值（0.427 0±0.029 4）高于GDM組（0.405 8± 0.012 3），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.604，P＜0.05）。

為及時了解滑坡體的演化過程，準(zhǔn)確捕捉特征信息，需對滑坡進行監(jiān)測，內(nèi)容包括地表變形、地下變形、地聲、應(yīng)變、水文以及降水量、地溫等其他環(huán)境因素。眾多可測量的數(shù)據(jù)中，位移是滑坡的最直接狀態(tài)量，且施測簡單，文章介紹了位移監(jiān)測的常用方法，簡述它們的基本原理和優(yōu)缺點。

2.4 GLUT3在GDM組和對照組胎盤組織中的表達

如圖3所示：GLUT3陽性表達主要分布于胎盤合體滋養(yǎng)細胞和血管內(nèi)皮細胞，主要位于細胞膜和細胞質(zhì)，呈散在表達，著色不均勻。對照組平均光密度值（0.418 0±0.008 7）高于GDM組（0.402 0± 0.012 1），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.485，P＜0.05）。

2.5 GLUT4在GDM組和對照組胎盤組織中的表達

如圖4所示：GLUT4陽性細胞表達主要分布于胎盤合體滋養(yǎng)細胞，主要位于細胞膜和細胞質(zhì)，著色不均勻。對照組平均光密度值（0.402 9±0.095 9）高于GDM組（0.391 3±0.008 4），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.466，P＜0.05）。

2.6 SHBG和GLUT1、GLUT3、GLUT4蛋白表達量的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示：SHBG和GLUT1在胎盤組織中的表達量無明顯相關(guān)性（R2=0.081，P＞ 0.05）；SHBG和GLUT3在胎盤組織中的表達量無明顯相關(guān)性（R2=0.051，P＞0.05），但是SHBG和GLUT4在胎盤組織中的表達量呈正相關(guān)（R2=0.410，P＜0.01）。見圖5。

3 討論

SHBG是一種由肝臟合成和分泌的能結(jié)合性激素甾體的微量糖蛋白，其基因編碼區(qū)位于第17對染色體的短臂（p12-13），由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成，長約3 kb［7］，并具有多態(tài)性。研究表明，GDM孕婦血清SHBG減少，SHBG可以作為GDM預(yù)測的一個標(biāo)志。近年的研究表明，SHBG不僅只由肝臟產(chǎn)生，還存在于胎盤等不同的性甾體激素靶組織［8～10］。本研究結(jié)果表明，GDM與正常孕婦胎盤滋養(yǎng)細胞中均存在SHBG蛋白表達，SHBG分布于合體滋養(yǎng)細胞的細胞膜與細胞質(zhì)，GDM組胎盤SHBG蛋白的表達低于正常孕婦，說明GDM時胎盤滋養(yǎng)細胞存在SHBG，但其合成和分泌水平低于正常孕婦，提示其對靶細胞攝取利用葡萄糖有一定影響，在GDM發(fā)病過程中可能起重要作用。

作為母嬰間葡萄糖轉(zhuǎn)運的載體蛋白和胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的最終步驟，GLUT在胎盤中的分布位置及表達數(shù)量必然對母嬰間的葡萄糖轉(zhuǎn)運和胰島素抵抗產(chǎn)生重要的影響。既往研究發(fā)現(xiàn)，胎盤中存在的GLUT主要是GLUT1和GLUT3，1998年Xing等［11］在足月胎盤的絨毛內(nèi)間質(zhì)細胞中發(fā)現(xiàn)了與胰島素受體共同表達的GLUT4。Ericsson等［12］的研究顯示，在妊娠早期合體滋養(yǎng)層細胞中檢測到GLUT4定位于胞質(zhì)的核周膜，但在足月胎盤中表達量明顯減少。本研究檢測了GLUT1、GLUT3和GLUT4在足月妊娠胎盤中的定位分布，結(jié)果顯示：胎盤中GLUT1的表達含量最高且分布較為廣泛，分布于細胞滋養(yǎng)細胞和合體滋養(yǎng)細胞，在微絨毛側(cè)的表達強度明顯高于基底膜側(cè)；GLUT3表達含量較少，散在分布于部分絨毛間質(zhì)的血管內(nèi)皮細胞中，在合體滋養(yǎng)細胞中也有明顯的表達；GLUT4表達含量最少，存在于部分合體滋養(yǎng)細胞的胞質(zhì)及胞膜中，提示GLUT1是足月胎盤中最主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運載體，在母嬰間葡萄糖轉(zhuǎn)運中可能發(fā)揮最主要的作用。

GLUT4是胰島素信號傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵分子，在胰島素作用下主要發(fā)揮攝取葡萄糖的作用，其蛋白表達下調(diào)可導(dǎo)致對胰島素的敏感性降低，產(chǎn)生胰島素抵抗［5］。本研究結(jié)果顯示：與對照組正常孕婦相比較，GDM孕婦胎盤內(nèi)GLUT4表達含量減少。由于GLUT4是胰島素信號傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵分子，其表達減少可能導(dǎo)致胰島素信號傳導(dǎo)通路減弱或受阻，從而加重胰島素抵抗程度。

本研究結(jié)果還顯示：在胎盤組織中，GLUT1、GLUT3表達量較多，但SHBG與其無明顯相關(guān)；GLUT4雖然表達量較少，SHBG與其卻有明顯的相關(guān)性。GLUT1、GLUT3主要在胎兒攝取葡萄糖的過程中發(fā)揮葡萄糖轉(zhuǎn)運作用，而GLUT4主要在胰島素傳導(dǎo)通路上發(fā)揮重要作用，提示SHBG參與了胰島素傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)。因此，推測胎盤組織中SHBG表達的下降可引起胰島素傳導(dǎo)通路受損，從而導(dǎo)致胰島素抵抗及GDM的發(fā)生。

［1］Smirnakis KV，Plati A，Wolf M，et al.Predicting gestational diabetes：choosingthe optimal early serummarker［J］.Am J Obstet Gynecol，2007，196（4）：410-416.

［2］McElduf A，Hitchman R，McElduf P.Is sex hormone-binding globulin associated with globulin tolerance［J］.Diabet Met，2006，23（3）：306-312.

［3］Kopp HP，F(xiàn)esta A，Krugluger W，et al.Low levels of sex hormonebinding globulin predict insulin requirement in patients with gestational diabetes mellitus［J］.Exp Clin Endocrinol Diabetes，2001，109（7）：365-369.

［4］Illsley NP.Glucose transportes in the human placenta［J］.Placenta，2000，21（1）：14-22.

［5］Joost HG，Thorens B.The extended GLUT-family of sugar/polyol transport facilitators：nomenclature，sequence characteristics，and potential function of its novel members（review）［J］.Mol Membr Biol，2001，18（4）：247-256.

［6］American Diabetes Association.Diagnosis and classification of diabetes mellitus［J］.Diabetes Care，2011，34（Suppl 1）：S62-S69.

［7］Perry JR，Weedon MN，Langenberg C，et al.Genetic evidence that raised sex hormone binding globulin（SHBG）levels reduce the risk of type 2 diabetes［J］.Hum Mol Genet，2010，19（3）：535-544.

［8］Larrea F，Diaz L，Carino C，et al.Evidence that human placenta is a site of sex hormone-binding gene expression［J］.J Steroid Biochem Mol Biol，1993，46（4）：497-505.

［9］Diaz L，Queipo G，Carino C，et al.Biologically active steroid and thyroid hormones stimulate secretion of sex hormone-binding globulin by human term placenta in culture［J］.Arch Med Res，1997，28（1）：29-36.

［10］Queipo G，Deas M，Arranz C，et al.Sex hormone-binding globulin stimulate chorionic gonadotrophin secretion from human cytotrophoblasts in cuiture［J］.Hum Reprod，1998，13（5）：1368-1373.

［11］Xing AY，Challier JC，Lepercq J，et al.Unexpected expression of glucose transporter 4 in villous stromal cells of human piacenta［J］.J Clin Endocrinol Metab，1998，83（11）：4097-4101.

［12］Ericsson A，Hamark B，Powell TL，et al.Glucose transporter isoform 4 is repressed in the syncytiotrophoblast of first trimester human piacenta［J］.Hum Reprod，2005，20（2）：521-530.

（編輯 王又冬）

Expression of SHBG and GLUTin Gestational Diabetes Placenta Tissue and Their Correlation

JIANG Jie-xuan，SUN Lei，JIN Zhen，XI Xiao-xue，ZHENG Yang，ZHANG Xuan，F(xiàn)ENG Chong
（Department of Obstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the expression of SHBG and GLUT proteins in the placenta tissue of gestational diabetes mellitus（GDM），and analyze their correlation.MethodsExpression of SHBG，GLUT1，GLUT3，and GLUT4 were detected by immunocytochemical staining in placenta tissues from 30 cases of GDM pregnant women and 30 cases of normal pregnant women.ResultsThe average optical density value of positive cells of SHBG，GLUT1，GLUT3，and GLUT4 in the placenta tissue of GDM pregnant women were 0.401 6±0.014 8，0.401 6±0.012 3，0.402 0± 0.012 1，and 0.391 3±0.008 4，respectively，which were 0.414 2±0.414 2，0.427 0±0.029 4，0.418 0±0.008 7，and 0.402 9±0.095 9 in the normal pregnant.The SHBG and GLUT protein expression in GDM pregnant women and normal women organizations were statistically different（P＜0.05）.Results of Pearson correlation analysis show that SHBG and GLUT4 expression in placenta tissue were positively correlated（R2=0.410 4，P＜0.05）.ConclusionGLUT1 is the most important glucose transporter in the placenta，and plays the main role in glucose transport between mother and baby.The GLUT 4 mainly plays an important role in the insulin pathway，and SHBG was involved in the regulation of the insulin pathway.

sex hormone binding globulin；glucose transporters classes；placenta；gestational diabetes mellitus

R71.25

A

0258-4646（2015）01-0005-05

國家自然科學(xué)基金（81170591；81300511）；沈陽市科學(xué)技術(shù)計劃項目（F11-262-9-46）

姜潔璇（1986-），女，碩士研究生.

金鎮(zhèn)，E-mail：jinzhen66@yahoo.com.cn

2014-09-11

網(wǎng)絡(luò)出版時間：