馮曉純， 段曉征， 朱浩宇， 延光海， 鄭美珠

蝎黃解痙治哮顆粒對哮喘小鼠模型中p38MAPK和Th1/Th2類細胞因子變化的影響

馮曉純， 段曉征， 朱浩宇， 延光海， 鄭美珠

目的 探討蝎黃解痙治哮顆粒對哮喘小鼠氣道炎癥和Th1/Th2類細胞因子變化的影響及其可能機制。方法 將24只6～8周齡雄性小鼠隨機分為正常對照組、哮喘模型組、小劑量中藥組、大劑量中藥組，每組6只。制備支氣管哮喘模型，小劑量中藥組、大劑量中藥組分別給予蝎黃解痙治哮顆粒免煎制劑每日0.72、2.89 g，按20 mL/kg配制成水混勻溶液灌胃每日2次，連續(xù)10 d；正常對照組和哮喘模型組小鼠給予等量生理鹽水。分別采用酶聯(lián)免疫吸附法和免疫印跡法檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)中白細胞介素4(IL-4)、IL-5、γ干擾素(IFN-γ)含量以及肺組織中磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)的變化，并觀察BALF中炎癥細胞和肺組織病理學改變。結果 哮喘模型組小鼠BALF中炎癥細胞計數(shù)、IL-4、IL-5含量水平升高和IFN-γ水平降低；肺組織中磷酸化p38MAPK表達水平升高，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。小、大劑量中藥組小鼠BALF中炎癥細胞計數(shù)、IL-4、IL-5含量水平下降和IFN-γ水平升高；肺組織中磷酸化p38MAPK表達水平降低，與哮喘模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。小、大劑量中藥組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 p38MAPK可能參與了支氣管哮喘的發(fā)病過程。蝎黃解痙治哮顆粒對哮喘小鼠具有保護作用，其機制可能與抑制p38MAPK磷酸化、調節(jié)Th1/Th2平衡失調、減輕炎癥細胞浸潤有關。

哮喘； 蝎黃解痙治哮顆粒； p38MAPK； Th1/Th2細胞因子； 小鼠； 動物，實驗

哮喘是一種病因尚不明確的復雜性疾病。在氣道炎癥發(fā)生中，T淋巴細胞占有主導地位[1]。在其復雜的發(fā)病機制中，對于輔助性Th1/Th2比例失衡會誘發(fā)哮喘發(fā)作的有關研究最為多見。Mosmann等[2]于1986年研究發(fā)覺小鼠CD4+T細胞以因子出現(xiàn)的模式及生理功效分為：以釋放白細胞介素2(interleukin 2，IL-2)和γ干擾素(interferon，IFN-γ)為主的視作Th1細胞亞群，參與細胞免疫應答；以釋放IL-4、IL-5為主的視作Th2細胞亞群，參與體液免疫應答。有研究證實，Thl/Th2類細胞之間失去平衡是誘發(fā)哮喘發(fā)作的主要因素之一[3]。p38MAPK作為細胞內重要的信息傳導者之一，參與了多種生理過程的調節(jié)，如發(fā)病機制、炎癥、細胞凋亡等作用尤為顯著，p38MAPK或許在哮喘的發(fā)病機制中扮演重要的角色[4]。而且，多種研究結果表明，p38MAPK通過作用于其下游各轉錄因子對IL-4等Th2類細胞分泌的炎癥因子進行的調節(jié)[5-6]。本研究通過觀察各哮喘小鼠BALF中的炎癥細胞總數(shù)、分類及計數(shù)、肺組織病理學變化和肺組織磷酸化p38MAPK蛋白的表達情況，分析蝎黃解痙治哮顆粒對它們的影響，為進一步明確哮喘的發(fā)病機制和蝎黃解痙治哮顆粒的臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡清潔級BALB/C雄性小鼠24只，體質量(18±5)g，由延邊大學醫(yī)學部實驗動物中心提供(合格證號：SCXK(吉)2011-0007)。24只小鼠按隨機數(shù)字表法分為正常對照組、哮喘模型組、小劑量中藥組、大劑量中藥組4個組，每組6只。

1.2 藥品與試劑 卵清白蛋白、氫氧化鋁凝膠(Sigma公司)，Diff-Quick染液(碧云天生物技術研究所)，mIL-4、mIL-5檢測試劑盒(深圳市達科生物技術公司)，IFN-γ檢測試劑盒(上海基免實業(yè)有限公司)，p-p38多克隆抗體(Mybiosource公司)。XW-502B型超聲霧化器(上海寰熙醫(yī)療器械有限公司)，RT-2100C酶聯(lián)免疫檢測儀(Sigma公司)；E-C電泳儀及電泳槽(美國A-C公司)；EV243電泳儀(英國柏楉)；Westernblot轉膜儀(BioRad公司)。

1.3 蝎黃解痙治哮顆粒藥品配制 蝎黃解痙治哮顆粒(麻黃、杏仁、苦參、白果、全蝎、甘草)由江陰天江藥業(yè)有限公司制備。小劑量按小鼠體質量14.9 g/kg，大劑量按小鼠體質量59.8 g/kg。

1.4 哮喘模型的建立 依據(jù)相關文獻[7]中記載的方法，除正常對照組外將其他組中每只小鼠腹腔注入溶于磷酸鹽緩沖液的10 μg卵清白蛋白及氫氧化鋁混合液0.5 mL處于致敏狀態(tài)。第21天開始每日同一時間持續(xù)3 d對小鼠施以激發(fā)實驗，使小鼠行霧化吸入，每次30 min。

1.5 給藥 實驗第17天開始連續(xù)給藥10 d，小、大劑量中藥組均定量定時給予蝎黃解痙治哮顆粒免煎制劑每日0.72、2.89 g，按20 mL/kg配制成水混勻溶液灌胃每日2次，連續(xù)10 d；正常對照組和哮喘模型組小鼠給予等量生理鹽水。

1.6 實驗樣本的制備 用無水乙醚處死小鼠后，切開小鼠的頸部皮膚，使氣管暴露，行氣管插管，1 mL注射器向氣管內分3次緩慢注入磷酸鹽緩沖液(1 mL氯化鈉)，緩慢的抽吸回收支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，將灌洗液收集入EP管中，暫放置于冰中凍存，并配平以3 000 r/min，離心5 min，留上清液400～600 μL于-80 ℃凍存待用。打開胸腔的同時分離雙肺，并提取左肺肺門中下段及左肺下葉，用生理鹽水沖洗，先后將提取的標本放置于-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆茫褂?0%甲醛固定液以4 ℃為標準將其儲存待用。

1.7 BALF中炎癥細胞因子IL-4、IL-5、IFN-γ含量的檢測 載玻片上涂抹的血液細胞和BALF的細胞用Diff-quik染色。取出染色后冷藏于-80 ℃冰箱中的BALF，在室溫內平衡20～30 min，應用ELISA Kit檢測上清液中IL-4、IL-5、IFN-γ細胞因子的含量。

1.8 肺組織磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)蛋白表達的檢測 分別實行肺組織細胞核及肺組織細胞漿提取、蛋白含量測定、采用Western Blot檢測方法使磷酸化p38MAPK SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉、加一抗、二抗實行免疫反應、化學發(fā)光、顯影、定影，最后凝膠圖像分析。

2 結果

2.1 各組小鼠BALF中的炎癥細胞總數(shù)、分類及計數(shù)的變化 見表1。

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與哮喘模型組比較，bP<0.05；與小劑量中藥組比較，cP<0.05。

表1結果表明，哮喘模型組及小、大劑量中藥組嗜酸性粒細胞計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)、炎癥細胞總數(shù)均顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。小、大劑量中藥組嗜酸性粒細胞計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)、炎癥細胞總數(shù)均顯著低于哮喘模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。大劑量中藥組在降低嗜酸性粒細胞計數(shù)、淋巴細胞計數(shù)、炎癥細胞總數(shù)水平上與小劑量中藥組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 各組小鼠BALF中炎癥細胞因子IL-4、IL-5、IFN-γ含量的變化 見表2。

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與哮喘模型組比較，bP<0.05；與小劑量中藥組比較，cP<0.05。

表2結果表明，哮喘模型組及小、大劑量中藥組BALF中細胞因子IL-4、IL-5含量較正常對照組均顯著增多，IFN-γ含量顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；小、大劑量中藥組IL-4、IL-5的含量較哮喘模型組減少，IFN-γ含量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。大劑量中藥組在降低小鼠BALF中細胞因子IL-4、IL-5的含量、升高IFN-γ含量的水平上與小劑量中藥組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 各組小鼠肺組織磷酸化p38MAPK蛋白表達的變化 見圖1。

經Western blot法檢測各組小鼠肺組織磷酸化p38MAPK蛋白的表達水平，見表3。

注：與正常對照組比較，aP<0.05；與哮喘模型組比較，bP<0.05；與小劑量中藥組比較，cP<0.05。

表3結果表明，哮喘模型組及小、大劑量中藥組小鼠肺組織磷酸化p38MAPK蛋白的表達水平明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。小、大劑量中藥組小鼠肺組織磷酸化p38MAPK蛋白的表達水平低于哮喘模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。大劑量中藥組小鼠肺組織磷酸化p38MAPK蛋白的表達水平低于小劑量中藥組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

支氣管哮喘是由多種細胞(如嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞、氣道上皮細胞等)及其組分共同作用于氣道誘發(fā)慢性炎性反應[8]。Th1主要分泌IFN-γ及IL-2等細胞因子，與細胞免疫調節(jié)有關；Th2主要分泌IL-4、IL-5和IL-13等炎性因子，使B淋巴細胞產生IgE，其與各種炎癥細胞如肥大細胞、嗜堿性粒細胞相結合，從而介導體液免疫，最終引起變態(tài)反應。當機體處于正常時，Th1/Th2處于相對平衡狀態(tài)，當機體受到異常刺激時，會導致Th1/Th2比例失衡，即Th1產生的IL-2、IFN-γ等因子含量減少，主要以IFN-γ含量減少為主；Th2產生的IL-4、IL-5及IL-13等因子含量增加，主要以IL-4、IL-5含量增多為主。其中IFN-γ可誘發(fā)Th1的分化，抑制Th2的增殖，使Th2更少的分泌炎癥因子，但當兩者失衡時，IFN-γ含量減少，Th2分泌的炎癥因子相對增加，促使IgE生成，介導體液免疫反應，誘發(fā)哮喘發(fā)生?？梢姡谙l(fā)生中，存在Th2類細胞因子的過分活躍，是誘發(fā)哮喘發(fā)生的重要因素。

p38MAPK通路是細胞內重要的信號通路，涉及哮喘氣道慢性炎癥、氣道高反應性以及氣道重構等多個方面[9-10]。p38MAPK通路是MAPK家族信號轉導通路之一，主要對多種炎癥細胞因子和多種類型的細胞應激信號進行轉導。p38MAPK通路能夠對細胞內氧化過程酶類表達起調控作用，誘導黏附蛋白的表達，調節(jié)免疫系統(tǒng)細胞的分化和增殖過程。研究證實，各種炎性介質的分泌及發(fā)揮均依靠磷酸化p38MAPK信息傳遞途徑。有研究已證明p38MAPK 的激活，不僅能促進單核巨噬細胞產生白細胞介素(IL-1、IL-4、IL-6、IL-8)等炎性因子，還可以介導中性粒細胞的活化。應用p38MAPK抑制劑能夠顯著抵制中性粒細胞趨化性和超氧化物產生、減輕炎癥反應，P38MAPK通過對轉錄因子的磷酸化來調控Th2類細胞因子的表達[10]。本研究結果顯示，經蝎黃解痙治哮顆粒治療后，與哮喘模型組相比，小、大劑量中藥組小鼠炎癥細胞計數(shù)及總數(shù)、IL-4及IL-5含量和肺組織中磷酸化p38MAPK蛋白的表達均較下降，IFN-γ含量升高，提示蝎黃解痙治哮顆粒對哮喘小鼠磷酸化p38MAPK蛋白表達有明顯的抑制作用，對Th1/Th2類細胞因子平衡有正向調節(jié)作用，可減少炎癥細胞的浸潤。其對哮喘小鼠的保護作用可能與此作用密切相關。同時，雖然經蝎黃解痙治哮顆粒大、小劑量中藥組干預后的哮喘小鼠BALF中炎癥細胞計數(shù)及總數(shù)、嗜酸性粒細胞的分泌、上皮細胞的改變、IL-4及IL-5含量的改變和肺組織中磷酸化p38MAPK蛋白的表達情況均較哮喘模型組有所顯著下降，但與正常對照組比較仍相對升高，提示可能存在沒有被蝎黃解痙治哮顆粒干預到的有某些其他機制也參與了哮喘的病變過程。因此，更深入的探索蝎黃解痙治哮顆粒的作用機制，使其得以全面的詮釋并應用于臨床意義重大。

[1] Kay AB. Allergy and allergic diseases. First of two parts. N Engl J Med，2001，344(1):30-37.

[2] Mosmann TR, Cherwinski H, Bond MW, et al. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secretedproteins[J]. J Immunol，1986，136(7):2348-2357.

[3] 上官文姬,沈惠風.支氣管哮喘免疫學發(fā)病機制的研究進展[J].上海交通大學學報：醫(yī)學版,2009,29(5):602-606.

[4] Kampen GT, Stafford S, Adachi T,et al. Eotaxin induces degranulation and chemotaxis of eosinophils through the activation of ERK2 and p38 mitogen-activated protein kinases[J]. Blood，2000，95(6):1911-1917.

[5] Tirumurugaan KG, Jude JA, Kang BN, et al. TNF-alpha induced CD38 expression in human airway smooth muscle cells: role of MAP kinases and transcription factors NF-kappaB and AP-1[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2007，292(6):L1385-1395.

[6] Chen CH, Zhang DH, LaPorte JM, et al.Cyclic AMP activates p38 mitogen-activated protein kinase in Th2 cells: phosphorylation of GATA-3 andstimulation of Th2 cytokine gene expression[J]. J Immunol，2000，165(10):5597-5605.

[7] Li TZ, Zhang WD, Yang GJ，et al. New flavonol glycosides and new xanthone from Polygala japonica[J]. J Asian Nat Prod Res，2006，8(5):401-409.

[8] 中華醫(yī)學會呼吸病學分會哮喘學組.支氣管哮喘防治指南(支氣管哮喘的定義、診斷、治療及教育和管理方案)[J].中華內科雜志,2003,42(11):817-822.

[9] Herlaar E, Brown Z. p38MAPK signalling cascades in inflammatory disease[J]. Mol Med Today，1999，5(10):439-447.

[10] 黃翠萍,楊和平,張珍祥，等.P38蛋白激酶對支氣管哮喘大鼠Th2類細胞因子表達的調控[J].中國病理生理雜志,2006,22(2):311-313.

(本文編輯：劉穎)

Effect of scorpion ephedra antispasmodic granules for asthma on p38MAPK and Th1/Th2 cytokines in a mouse model of asthma

FENGXiaochun，DUANXiaozheng，ZHUHaoyu，YANGuanghai，ZHENGMeizhu.

DepartmentofPediatrics,AffiliatedHospitalofChangchunUniversityofTraditionalChineseMedicine，Changchun130021，China.

Objective To explore the effect of scorpion ephedra antispasmodic granules for asthma on airway inflammation in asthmatic mice and Th1/Th2 type cytokines changes and its possible mechanism.Methods Totally 24 male mice of only 6 to 8 weeks old were randomly divided into four groups:normal control group, asthma model group, small-dose traditional Chinese medicine group, large-dose Chinese medicine group, 6 mice in each group. Make bronchial asthma model, and the samll-dose traditional Chinese medicine group and large-dose TCM group were given scorpion ephedra antispasmodic granules for asthma to let boiled preparation, 0.72 and 2.89 g daily to make 20 mL/kg aqueous mix solution for stomach irrigation twice a day, for 10 days; normal control group and the asthma model group were given the equal amount of saline. Enzyme linked immune sorbent assay and immunoblotting were used to detect leukocyte mediated-4(IL-4), IL-5, interferon gamma(IFN-γ) content in bronchial alveolar irrigation lavage fluid (BALF) and phosphorylated p38 mitogen activated protein kinase(p38MAPK) changes in the lung tissue, and the pathological changes of inflammatory cells in BALF and lung tissue were observed.Results In BALF of asthmatic model group,inflammatory cell count, IL-4 and IL-5 levels increased and IFN-γlevels decreased; in lung tissues phosphorylated p38MAPK expression level increased, and compared with the normal control group, the difference was statistically significant(P<0.05). The inflammatory cell counts, IL-4 and IL-5 levels decreased and IFN-γ levels increased, in BALF of large-dose Chinese medicine group increased; in lung tissues the phosphorylated p38MAPK expression level reduced, and compared with the asthma model group, the differences were statistically significant(P<0.05). Comparing small with large-dose TCM group, the difference was not statistically significant(P>0.05). Conclusion p38MAPK may be involved in the pathogenesis of bronchial asthma. Scorpion ephedra antispasmodic granules for asthma has a protective effect on asthma in mice, and the mechanism may be related to inhibiting p38MAPK phosphorylation, regulating the imbalance of Th1/Th2 cells and reducing the inflammatory cell infiltration.

asthma; scorpion ephedra antispasmodic granules for asthma; p38MAPK; Th1/Th2 cytokine; mouse； animal, experiment

吉林省科技發(fā)展計劃項目(20130102068JC)

130021 長春，長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院兒科(馮曉純，段曉征，朱浩宇)；133002 吉林 延吉，延邊大學醫(yī)學院解剖教研室(延光海)；130021 長春，長春中醫(yī)藥大學研究生院(鄭美珠)

馮曉純(1960-)，女，醫(yī)學碩士，教授、主任醫(yī)師，博士研究生導師。研究方向：小兒肺系疾病的中西醫(yī)結合治療。

10.3969/j.issn.1674-3865.2015.04.007

R-33

A

1674-3865(2015)04-0316-04

2015-04-10)