■柳 茜 楊文嬌 吳 振 梁萌青 鄭珂珂 牟玉超

（1.中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東青島 266071；2.唐山拓普生物科技有限公司，河北唐山 063021）

酵母水解物（Autolzed Yeast），是采用新鮮啤酒酵母為原料，采用現(xiàn)代生物工程技術，經除雜、自溶、酶解、噴霧干燥等工藝精制而成。酵母水解物富含核酸、核苷酸、小肽、細胞壁多糖（免疫多糖）、游離氨基酸及豐富的B族維生素[1-2]。氨基酸和小肽易于消化吸收，在動物蛋白質營養(yǎng)中優(yōu)勢顯著，因此酵母水解物是一種非常理想的功能性蛋白源，可以作為飼料中優(yōu)質蛋白原料（如魚粉）的替代物[3-4]。此外，小肽可以加速蛋白質合成，提高動物機體免疫力[5]。核苷酸及B族維生素具有提高機體免疫力和抗氧化能力的作用[6-9]。酵母細胞壁多糖因其特殊構型，尤其啤酒酵母由于多代次的特殊優(yōu)勢，更厚的胞壁，提供更豐富的免疫多糖，易被免疫系統(tǒng)接受，激活機體巨噬細胞，并誘導機體產生一系列的細胞免疫和體液免疫反應，從而增強動物免疫力，改善其健康狀況。目前，酵母或酵母提取物等作為蛋白質來源或飼料添加劑在淡水魚（鯉魚、豐鯉、淡水白鯧、鳊、草魚、異育銀鯽等）中的應用已有研究[10]，但是酵母水解物作為蛋白質來源或飼料添加劑在海水魚中研究較少。

大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)是一種底棲的肉食性海水魚類，是我國北方重要的海水養(yǎng)殖品種之一。目前，大菱鲆的基本營養(yǎng)需求已經明確，因此如何通過營養(yǎng)途徑進行健康養(yǎng)殖逐漸成為人們關注的焦點。本研究利用以魚粉、豆粕、玉米蛋白粉、谷朊粉和酵母粉為復合蛋白源配制的精飼料，探究酵母水解物對大菱鲆非免疫性免疫力及抗應激能力的影響，為酵母水解物在大菱鲆人工配合飼料中的應用積累資料。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚

大菱鲆幼魚購自青島市通用水產養(yǎng)殖有限公司。試驗開始前，停食24 h，隨機挑選大小均勻、體格健壯且體表無病，平均體重(6.17±0.06)g的大菱鲆幼魚360尾，隨機平均分配到4×3個養(yǎng)殖桶（40 cm×50 cm×100 cm）中。

1.2 試驗飼料

試驗飼料原料購自青島七好生物科技有限公司。飼料原料粉碎后，過80目篩網備用。以30%魚粉組為對照組，以酵母水解物及酵母粉及植物蛋白分別替代10%、15%、20%魚粉，配制成等氮、等能的4種試驗飼料。試驗飼料配方及營養(yǎng)成分見表1。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)成分分析

1.3 飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗采用流水培育，養(yǎng)殖水體水溫(16±1)℃，pH值7.6～8.2，連續(xù)充氧，溶氧含量保持在6 mg/l以上。每天人工表觀飽食投喂兩次（6:30和16:30），投喂后0.5 h換水以排除殘餌，試驗為期8周。

1.4 樣品采集與分析

試驗結束后，饑餓24 h，稱每桶魚總重。然后每桶隨機取6尾魚，用1.0 ml一次性無菌注射器(含肝素鈉)尾靜脈采血，置于4℃冰箱過夜，在2 500 r/min離心10 min，分離血清，-20℃冰箱保存，待測；取肝臟，-20℃冷凍保存，待測；每桶隨機撈取3尾魚，用于常規(guī)分析。

血清溶菌酶（LZM）、肝臟酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、一氧化氮合酶（NOS）、肝臟總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性及肝臟丙二醛（MDA）含量均采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒測定。

1.5 抗應激試驗

1.5.1 耐低氧能力測定

參照池田(1976)的方法進行，即飼喂結束24 h后，從各試驗組分別隨機撈取10尾供試魚，放入盛有2.0 L養(yǎng)殖桶水的泡沫箱中。將全部魚放入泡沫箱中后，開始計時并觀察各組試驗魚的呼吸情況。待10尾試驗魚中的8尾停止鰓蓋自主張合動作后，將其全部撈起放入原養(yǎng)殖桶中，連續(xù)充氧繼續(xù)觀察2.0 h，記錄各試驗組恢復自主呼吸的魚體數(shù)量。根據(jù)各試驗組魚停止鰓蓋自主張合時間和恢復自主呼吸的魚體數(shù)量，評價各組魚耐低氧的能力。

1.5.2 抗干旱能力測定

從各試驗組中分別隨機撈取10尾試驗魚，進行抗干旱能力的測定。具體做法是將撈起的試驗魚放在干燥的塑料筐中，連續(xù)觀察魚體的動態(tài)，待10尾試驗魚中的8尾停止鰓蓋自主張合運動后，將其全部放入原養(yǎng)殖桶中，連續(xù)充氧繼續(xù)觀察2.0 h，記錄各試驗組恢復自主呼吸的魚體數(shù)量。根據(jù)各組魚停止鰓蓋自主張合時間和恢復自主呼吸的魚體數(shù)量，評價各組魚抗干旱的能力。

1.5.3 抗低鹽度應激能力測定

從各試驗組分別隨機撈取10尾供試魚，放入盛有4 L淡水、連續(xù)充氧的泡沫箱中，將全部魚放入泡沫箱中后，開始計時并觀察各組試驗魚的呼吸情況。記錄試驗組和對照組魚全部停止鰓蓋自主張合的時間，評價試驗組和對照組魚的耐低鹽能力。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進行單因素方差分析（Oneway ANOVA），差異顯著（P＜0.05）后，進行鄧肯氏多重比較（Duncan's multiple range tests），所有試驗數(shù)據(jù)采用“平均值±標準差”表示。

2 結果

2.1 飼料中酵母水解物對大菱鲆幼魚免疫相關酶活性的影響（見表2）

表2 酵母水解物對大菱鲆幼魚免疫相關酶活性的影響

由表2可見，添加酵母水解物的各試驗組血清溶菌酶（LZM）、肝臟酸性磷酸酶（ACP）和一氧化氮合酶（NOS）活性均顯著高于對照組（P＜0.05）；YH-1組肝臟堿性磷酸酶活性高于對照組，但差異不顯著（P＞0.05）；YH-2及YH-3組肝臟AKP活性顯著高于對照組（P＜0.05）；且血清LZM、肝臟ACP、AKP和NOS活性隨著酵母水解物的含量增加呈先上升后下降的趨勢；YH-2組的LZM、AKP、NOS活性顯著高于YH-1和YH-3組（P＜0.05）；YH-2組的肝臟ACP活性略高于YH-1和YH-3組，但差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 飼料中酵母水解物對大菱鲆幼魚肝臟抗氧化能力的影響（見表3）

表3 酵母水解物對大菱鲆幼魚肝臟抗氧化能力的影響

由表3可知，YH-1組肝臟總抗氧化能力(T-AOC)顯著高于對照組（P＜0.05），YH-2、YH-3組T-AOC則顯著低于對照組（P＜0.05）；添加酵母水解物的各試驗組超氧化物歧化酶（SOD）活性均顯著高于對照組（P＜0.05）；YH-2組的SOD活性顯著高于YH-1、YH-3組；YH-1、YH-2組肝臟丙二醛（MDA）含量與對照組（YH-0）相比無顯著差異（P＞0.05）；YH-2組的過氧化物酶（POD）活性略高于YH-0、YH-1組，但差異不顯著（P＞0.05）；YH-0、YH-1和YH-2三組POD活性均顯著高于YH-3組（P＜0.05）。

2.3 飼料中酵母水解物對大菱鲆幼魚抗應激能力的影響（見表4）

表4 酵母水解物對大菱鲆幼魚抗應激能力的影響

由表4可知，各試驗組耐干旱時間和耐干旱存活率差異不顯著（P＞0.05）；YH-3組的耐干旱時間大于YH-0組；YH-1、YH-2組的耐干旱存活率高于對照組，但無顯著差異（P＞0.05）；YH-1組與YH-0組的耐低氧時間差異不顯著（P＞0.05），YH-0、YH-1組耐低氧時間均顯著高于YH-2、YH-3組（P＜0.05）；添加酵母水解物的各試驗組的耐低氧存活率顯著高于對照組（P＜0.05）；添加酵母水解物各試驗組大菱鲆幼魚的耐低鹽時間顯著高于對照組（P＜0.05），其中YH-2組耐低鹽時間顯著高于其他三組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 飼料中酵母水解物對大菱鲆幼魚免疫相關酶活性的影響

LZM是一種堿性蛋白，能水解細菌細胞壁中黏肽的乙酰氨基多糖并使之裂解被釋放出來，形成一個水解酶體系，從而破壞和消除侵入體內的異物，實現(xiàn)機體防御功能[11]。王武剛對凡納濱對蝦的研究中，魚粉替代量為15%時，血清LZM活性顯著高于對照組，替代量大于15%后，各替代組血清LZM活性均低于對照組[3]。這與本研究結果一致，YH-2組LZM活性最高，添加量大于2%時其活性下降，說明適量的酵母水解物可提高大菱鲆幼魚的LZM活性，而過高的添加量可能會有抑制作用。

AKP和ACP是兩種重要的水解酶，對細菌等異物在溶酶體內的消化降解具有重要作用。在本研究中，YH-2組的AKP、ACP活性最高，隨著飼料中酵母水解物含量進一步提高，其活性下降。NO是吞噬細胞發(fā)揮細胞毒作用的一種有效分子，一些非免疫細胞在激活時也能大量釋放NO。NO的生物合成依賴于NOS[12]。本研究結果表明，酵母水解物可提高大菱鲆幼魚肝臟NOS活性。

酵母水解物提高機體免疫能力，可能與其核苷酸、B族維生素等功能性物質含量豐富有關。Sajeevan曾指出核苷酸可作為水產動物的免疫增強劑[13]。王廣軍等研究表明，飼料中添加酵母核苷酸可提高凡納濱對蝦肌肉組織中LZM、ACP活性[14]。許丹丹等研究表明，飼料中添加核苷酸混合物可顯著提高凡納濱對蝦肝胰腺堿性磷酸酶(AKP)活性[7]。周小秋指出，B族維生素可以通過提高血清LZM活性和血清ACP活性增強殺菌能力，通過增強血清總鐵結合力提高抑菌能力，通過提高血清凝集素水平和血清補體含量促進白細胞吞噬作用，從而增強魚體的非特異性免疫力[9]。劉立鶴等指出，酵母水解物粉狀或膏狀產品中都含有17%～30%的β-葡聚糖和甘露寡糖，這對于改善腸道微生態(tài)、增強水產動物的非特異性免疫能力具有重要的作用[15]。酵母水解物中含有酵母細胞壁多糖，能刺激免疫，促進免疫器官發(fā)育[16]。近年來的研究證實，β-葡聚糖能夠提高溶菌酶的活性，提高免疫相關酶的活性，并能夠活化B細胞和T細胞。

3.2 飼料中酵母水解物對大菱鲆幼魚肝臟抗氧化能力的影響

T-AOC可以反映機體酶促和非酶促系統(tǒng)的抗氧化能力[17]。本研究中，YH-1組的T-AOC顯著高于對照組（P＜0.05）。SOD可以消除體內多余的自由基，是機體清除氧自由基的重要抗氧化保護酶，它能促使自由基的形成和清除處于動態(tài)平衡，從而清除自由基對機體的危害，保護細胞免受損傷。當SOD活性降低時，其自由基等毒害物質就會積累[11]。丙二醛（MDA）是生物膜中的不飽和脂肪酸受到活性氧攻擊，發(fā)生脂質過氧化的終產物，其含量可反映體內脂質過氧化強弱，間接反映組織細胞氧化損傷的程度。本研究中，YH-2組的SOD、POD活性高于其他組；YH-2組的MDA含量低于YH-0和YH-3組。綜合上述指標，酵母水解物可以提高大菱鲆幼魚肝臟抗氧化能力，且YH-2組大菱鲆幼魚的肝臟抗氧化能力最強。這與王武剛對凡納濱對蝦的研究結果一致[3]。

酵母水解物提高大菱鲆幼魚的抗氧化能力可能與其中含有豐富的B族維生素、核苷酸和小肽有關。有研究表明，隨著硫胺素、核黃素、煙酸、泛酸、吡哆醇和肌醇添加量的提高，幼建鯉血清和肌肉MDA含量顯著或極顯著下降，血清、肝胰臟、腸道、后腎和肌肉等的一種或多種組織SOD活性顯著或極顯著提高[9]。許丹丹等研究表明，飼料中添加外源核苷酸可顯著提高凡納濱對蝦肝胰臟的T-AOC活性(P＜0.05)，提高血清SOD活性(P＞0.05)[7]。苗新等研究表明，飼料中核苷酸添加量為300 mg/kg時，可顯著提高大黃魚血清SOD活性和T-AOC的活性，從而提高機體抗氧化能力[18]。王廣軍等研究顯示，在飼料中添加酵母核苷酸可顯著提高凡納濱對蝦肌肉組織中的SOD、POD活性[14]。姜柯君等對星斑川鰈的研究中，飼料中添加適量小肽后，肝臟和血清的SOD活性升高，MDA含量顯著降低(P＜0.05)[19]。

3.3 飼料中酵母水解物對大菱鲆幼魚抗應激能力的影響

應激反應是魚體對各種環(huán)境因子的超常刺激所產生的一種非特異性生理反應。過度的應激不僅影響魚類的生產性能，還會誘發(fā)多種疾病，甚至造成死亡[20]。本研究中，飼料中添加酵母水解物可提高大菱鲆幼魚耐干旱及耐低氧應激的存活率，顯著延長大菱鲆幼魚耐低鹽應激時間（P＜0.05）。由此可見，飼料中添加酵母水解物可提高大菱鲆幼魚的抗應激能力。這可能與酵母水解物中豐富的核苷酸含量有關。Superchi等對仔豬的研究表明，在仔豬斷奶前補充日糧核苷酸能提高斷奶應激的適應能力[21]。王廣軍等研究表明，飼料中添加酵母核苷酸可提高凡納濱對蝦的抗應激能力[14]。

酵母水解物提高大菱鲆幼魚的抗應激能力還可能與其中含有的酵母免疫多糖有關，酵母多糖可增加動物對外界不良刺激的適應性。研究顯示，酵母細胞壁多糖可提高異育銀鯽和草魚的抗應激能力[20，22]。

4 結論

飼料中添加酵母水解物可提高大菱鲆幼魚機體免疫能力、肝臟抗氧化性能和抗應激能力；且在本試驗條件下，以添加2%的酵母水解物的效果最佳。