■計(jì) 成 趙麗紅 李笑櫻 劉淑靜

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

科技的進(jìn)步推動(dòng)了人類社會(huì)的全面發(fā)展，農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)的發(fā)展使人們?cè)跐M足物質(zhì)生活的同時(shí)，越來(lái)越多地關(guān)心畜產(chǎn)品和食品的質(zhì)量和安全。諸如瘦肉精、三聚氰胺、牛奶黃曲霉毒素M1超標(biāo)事件的發(fā)生，使人們更加警示和關(guān)注畜產(chǎn)品安全問(wèn)題。全球飼料霉菌毒素污染具有普遍性和嚴(yán)重性，隨時(shí)隨地危害畜禽生產(chǎn)和人類食品安全。美國(guó)早在2002年已將霉菌毒素列為對(duì)人類食物鏈造成巨大威脅的危險(xiǎn)因素，其毒性僅次于二噁英。谷物糧食等作物在田間就會(huì)感染霉菌，如果環(huán)境溫度、濕度適合，在運(yùn)輸、加工、儲(chǔ)存過(guò)程中霉菌會(huì)繼續(xù)繁殖生長(zhǎng)，毒素含量相應(yīng)會(huì)繼續(xù)增加。飼料霉變給糧食工業(yè)和畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）估計(jì)，全球每年25%的谷物受到霉菌毒素的污染，平均有2%不能食用造成浪費(fèi)；加之因采食霉變飼料引起的動(dòng)物中毒、疾病和死亡，造成的危害和損失數(shù)據(jù)難以統(tǒng)計(jì)。

1 嘔吐毒素污染概況

谷物飼料易受鐮孢菌、頭孢霉、漆斑菌和其它一些霉菌污染，所產(chǎn)生的鐮孢霉毒素對(duì)人類和動(dòng)物健康有極大的危害[1]。鐮孢霉毒素中最重要、數(shù)量最多的毒素是單端孢霉烯類毒素（Trichothecenes,TS），該類毒素包括約150種化合物，大致劃分為A類、B類等四個(gè)亞類。A類單端孢霉烯毒素包括：T-2毒素、HT-2毒素、雙乙酸基藨草烯醇（DAS）和鐮孢菌酸（NEO）；B類單端孢霉烯毒素包括：脫氧瓜萎鐮孢菌烯醇（又名嘔吐毒素,DON）、雪腐鐮孢菌烯醇（NIV）和鐮孢菌烯酮-X等[2]。

嘔吐毒素對(duì)谷物的污染程度居于鐮刀菌毒素之首，對(duì)動(dòng)物健康造成巨大威脅。嘔吐毒素的化學(xué)名稱為3α,4β,7α,15-四羥墓蔗草鐮孢菌-9-烯-8-酮，分子式為C15H20O6，分子量為296.3，多分布于小麥、大麥、玉米等谷物籽實(shí)中[3]。加拿大小麥中嘔吐毒素的含量高達(dá)8.5 mg/kg，南非玉米嘔吐毒素的含量高達(dá)160 mg/kg，埃及有50%的谷物中有嘔吐毒素，含量為0.07～4.0 mg/kg。中國(guó)配合飼料樣品中嘔吐毒素陽(yáng)性檢出率高達(dá)100%，平均含量為0.6 mg/kg。飼料或糧食中DON含量超過(guò)1 mg/kg時(shí)會(huì)對(duì)人和動(dòng)物健康產(chǎn)生危害，因此，美國(guó)食品藥物管理局規(guī)定食品中DON限量標(biāo)準(zhǔn)為1 mg/kg，我國(guó)農(nóng)業(yè)部也對(duì)動(dòng)物飼料中DON的限量標(biāo)準(zhǔn)做了規(guī)定，其值也不應(yīng)超過(guò)1 mg/kg[4]。課題組2011年對(duì)北京市15個(gè)代表性養(yǎng)豬場(chǎng)所用飼料原料和全價(jià)配合飼料（131份）霉菌毒素污染情況、檢出頻率和特點(diǎn)進(jìn)行調(diào)研，結(jié)果表明：玉米、麩皮、豆粕、DDGS和配合飼料中各類霉菌毒素的檢出率都非常高，其中玉米、DDGS和部分全價(jià)配合飼料所含毒素超標(biāo)率很高，而嘔吐毒素的超標(biāo)率最高，玉米嘔吐毒素超標(biāo)率為57.1%，DDGS超標(biāo)率為88.2%，豬配合飼料嘔吐毒素超標(biāo)率為15.8%[5]。

2 動(dòng)物嘔吐毒素中毒癥及毒理作用機(jī)制

不同動(dòng)物對(duì)DON的敏感性不同，豬對(duì)其最敏感，牛、羊次之，家禽對(duì)DON有較高的耐受力。豬DON最明顯的中毒特征為：嘔吐、拒食、腹痛、腹瀉，解剖發(fā)現(xiàn)胃腸道炎癥、出血等癥狀，長(zhǎng)時(shí)間采食DON可延緩豬的生長(zhǎng)、降低免疫機(jī)能[6]。家禽DON中毒癥：采食量和增重下降，解剖發(fā)現(xiàn)口腔潰瘍，肌胃糜爛，死亡率升高。牛DON中毒表現(xiàn)：體質(zhì)衰弱，采食量下降，生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)奶量降低，受孕率低。據(jù)Danicke（2002）[7]報(bào)道，豬日糧中DON含量在1 mg/kg、犢牛2 mg/kg、家禽5 mg/kg，即可影響其采食量和增重。豬的日糧中DON含量達(dá)2 mg/kg時(shí)，24 h后常出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、肌無(wú)力，甚至昏迷。DON對(duì)人類健康的危害研究已經(jīng)證明，發(fā)霉玉米中的DON對(duì)人產(chǎn)生食物中毒性白細(xì)胞缺乏癥（ATA）。人的中毒癥狀主要表現(xiàn)為胃部不適，惡心、嘔吐、頭痛、頭暈、腹痛、腹瀉等。有資料顯示，曾在前蘇聯(lián)、中國(guó)及北美等國(guó)家和地區(qū)爆發(fā)過(guò)人類食物中毒性白細(xì)胞缺乏癥病，發(fā)病率和死亡率均較高。在我國(guó)食管癌、胃癌高發(fā)區(qū)居民飲食中DON污染率和含量均相當(dāng)高。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）已將嘔吐毒素列為三類致癌物之一。

嘔吐毒素的毒性基團(tuán)是C12,13-環(huán)氧基，該毒性基團(tuán)對(duì)生長(zhǎng)較快的細(xì)胞（胃腸道黏膜細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞等）有較強(qiáng)的損傷作用，而且還抑制蛋白質(zhì)的合成。DON的毒理作用機(jī)制可總結(jié)為：DON在代謝過(guò)程中，第9位分子官能團(tuán)由羥基生成了酯類，再與細(xì)胞核糖體結(jié)合，通過(guò)切斷某些肽鍵和肽鏈而破壞核糖體功能結(jié)構(gòu)，干擾位于核糖體60S亞基上的肽基轉(zhuǎn)移酶活性中心，最終抑制蛋白質(zhì)的合成[8]。當(dāng)DON進(jìn)入細(xì)胞后，強(qiáng)烈地與核糖體結(jié)合，并給雙鏈RNA蛋白激酶（PKR）和造血細(xì)胞激酶（HcK）轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)；同時(shí)，核糖體的中毒性應(yīng)激反應(yīng)使p38和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）活性降低，抑癌基因p53和轉(zhuǎn)錄因子c-Jun磷酸化被誘導(dǎo)，進(jìn)一步使絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化，激活體內(nèi)MAPKs信號(hào)通路，從而引起機(jī)體各種生理反應(yīng)[9]。其信號(hào)傳導(dǎo)的具體機(jī)制尚不很清楚，兩種假說(shuō)，一種可能是由蛋白質(zhì)介導(dǎo)的，一種可能是由于DON損害了28S rRNA基因造成的。

真核生物體內(nèi)MAPKs鏈?zhǔn)切盘?hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑，在將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，并引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)的過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。目前已發(fā)現(xiàn)3條并行的MAPKs信號(hào)通路（ERK、JNK/SAPK和p38）參與了DON激活的MAPK過(guò)程[10]。當(dāng)ERK、JNK/SAPK和p38接受上游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)信號(hào)后，不僅可以磷酸化胞漿蛋白，而且可以轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化一些核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子（c-fos、c-Jun、Elk-1、c-myc 和ATF-2），使下游一系列致炎細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）大量表達(dá)[11-12]，從而參與細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控。

最近研究表明，DON還可引起線粒體細(xì)胞凋亡基因Bax的易位和細(xì)胞色素C的釋放。DON引起線粒體細(xì)胞色素C釋放，激活caspase-9凋亡啟動(dòng)分子，再激活caspase-3凋亡作用分子，引起細(xì)胞凋亡[13-14]。不僅如此，DON還可使線粒體跨膜能力下降，釋放大量的O2-·，導(dǎo)致線粒體膜兩側(cè)的離子失去平衡，線粒體外膜發(fā)生破裂，以改變線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔道（PTP）的開閉狀態(tài)的方式介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。

3 嘔吐毒素解毒、去毒方法

嘔吐毒素對(duì)畜牧業(yè)及人類產(chǎn)生如此嚴(yán)重的危害，因此，如何實(shí)現(xiàn)該類毒素的解毒、去毒是畜牧工作者研究的重要課題。迄今為止，已知的去除飼料中嘔吐毒素的方法有物理、化學(xué)和生物學(xué)法。

物理去毒方法包括研磨，密度篩選，使用紫外光、γ-射線照射以及添加霉菌毒素吸附劑等。嘔吐毒素能溶于水，將受其污染的谷物濕磨碎后，嘔吐毒素會(huì)在浸漬液中富集，淀粉中只含有少量毒素。谷物和油料籽實(shí)的密度篩選法是根據(jù)受污染和不受污染谷物籽實(shí)的密度差異，采用浮選法將它們重新分流，從而將二者區(qū)分開來(lái)的方法，這種方法能夠顯著降低嘔吐毒素的濃度。易感染嘔吐毒素的玉米和小麥很適用于這種方法。目前，應(yīng)用較廣的物理去毒方法是霉菌毒素吸附劑法，包括硅藻土、黏土、硅鋁酸鹽、酵母細(xì)胞壁提取物、酯化甘露聚糖、葡甘露聚糖等。但大量試驗(yàn)證實(shí)霉菌毒素吸附劑只對(duì)飼料中的黃曲霉毒素（AFB）有較好的吸附效果（大約能吸附70%左右的AFB1），而對(duì)DON的吸附率不足5%。因此，目前對(duì)于飼料DON的去除沒(méi)有更好的解決方法。

上述諸多物理、化學(xué)脫毒方法因其具有不可避免的缺陷，如飼料經(jīng)化學(xué)脫毒處理后營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和適口性降低，吸附劑吸附法只對(duì)黃曲霉毒素有吸附效果，對(duì)其他毒素?zé)o效，吸附毒素同時(shí)還吸附維生素和礦物元素，因此對(duì)養(yǎng)殖者來(lái)說(shuō)都不太適用，沒(méi)有被廣泛應(yīng)用。生物降解法因其具有高效性、環(huán)保性而成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。

4 嘔吐毒素生物降解研究進(jìn)展

微生物降解是目前對(duì)嘔吐毒素污染削減研究的重點(diǎn)。有研究表明，DON結(jié)構(gòu)中C12和C13位的環(huán)氧結(jié)構(gòu)和C3-OH基團(tuán)是DON的主要毒性基團(tuán)，也是生物降解主要研究位點(diǎn)(見圖1)。

4.1 開環(huán)氧化作用

20世紀(jì)70年代，Sato等[16]報(bào)道植物中的硫醇類物質(zhì)對(duì)C12和C13位環(huán)氧結(jié)構(gòu)具有親核攻擊作用，還原劑破壞環(huán)氧結(jié)構(gòu)后生成烯烴，水解后生成兩個(gè)相鄰的-OH基團(tuán)。Yoshizawa等[17-18]報(bào)道，動(dòng)物腸道中的細(xì)菌可以將DON中的C12和C13環(huán)氧結(jié)構(gòu)降解為C9和C12形成雙鍵的物質(zhì)。同時(shí)，研究證明牛瘤胃和腸道中的混合微生物可將單端孢霉烯中的環(huán)氧結(jié)構(gòu)破壞，但瘤胃和腸道中的純培養(yǎng)物對(duì)DON的環(huán)氧結(jié)構(gòu)沒(méi)有作用，可能是這些細(xì)菌嚴(yán)格厭氧，具有復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)需求。Binder等[19]從牛瘤胃的富集培養(yǎng)物中分離到一株可轉(zhuǎn)化DON和其他單端孢霉烯族毒素的厭氧優(yōu)桿菌屬細(xì)菌（Eubacterium BBSH797），隨后的試驗(yàn)確定了菌株BBSH797降解DON的代謝產(chǎn)物為DOM-1[20]。He等[21]從雞腸道中分離篩選出微生物可將98%以上的DON在96 h內(nèi)轉(zhuǎn)化為DOM-1。Eriksen等[6]通過(guò)毒性試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，DOM-1的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于DON，為DON的1/55。Yu等[22]采用PCR-DG?GE方法從雞腸道中分離了10株具有將DON轉(zhuǎn)化為DOM-1的菌株。Guan等[23]從褐色大頭鯰腸道中分離得到微生物混合物C133，該混合物在完全培養(yǎng)基中將DON轉(zhuǎn)變?yōu)镈OM-1。Li等[24]通過(guò)仔豬飼喂試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株LS100具有將DON轉(zhuǎn)化為DOM-1的能力，且降解產(chǎn)物DOM-1不會(huì)對(duì)豬產(chǎn)生負(fù)面影響。

圖1 DON推測(cè)的作用位點(diǎn)

4.2 3C-糖苷化、異構(gòu)化和氧化作用

3C-糖苷化作用是微生物產(chǎn)生的糖苷酶或者乙酰基轉(zhuǎn)移酶將葡萄糖基或者乙?；D(zhuǎn)移到DON的3號(hào)位碳原子上，生成毒性比DON低的降解產(chǎn)物DON-葡糖苷酸或者3-ADON，據(jù)推測(cè)正是由于乙?；D(zhuǎn)移酶的存在，才使鐮刀霉可以抵抗自身產(chǎn)生毒素的毒性[25]。Poppenberger等[26]從阿拉伯芥中分離出UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶可以將一分子葡萄糖基轉(zhuǎn)移到DON的3號(hào)位碳源子上，得到DON-葡糖苷酸。進(jìn)一步試驗(yàn)結(jié)果表明，DON-葡萄糖苷酸的毒性作用比DON低[27]。Ma等[28]從小麥（Triticum aestivum L.）變種中獲得UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因片段（TaUGT3），其在大腸桿菌DH10B中成功表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)接種這種大腸桿菌的擬南芥提高了對(duì)DON的抵抗能力。Khatibi等[29]將2種3-O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因片段（FgTRI101和Ff?TRRI201）克隆到酵母菌中成功表達(dá)，可有效將燃料酒精發(fā)酵副產(chǎn)物中的高濃度DON轉(zhuǎn)化為3-ADON，這一研究有一定的商業(yè)推廣應(yīng)用價(jià)值。

3C-異構(gòu)化作用使DON形成C-3位差向異構(gòu)體3-epi-DON，但由于該降解產(chǎn)物中仍存在12,13-環(huán)氧化基團(tuán)，其毒性作用與DON相當(dāng)。Ikunaga等[30]從小麥地里分離到一株諾卡氏細(xì)菌WSN05-2可將DON轉(zhuǎn)化為3-epi-DON和另一種結(jié)構(gòu)還未闡明的降解產(chǎn)物。在含有1 000 μg/ml的DON的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中接種WSN05-2菌株反應(yīng)7 d后，DON的轉(zhuǎn)化率可達(dá)90%。10 d后兩種降解產(chǎn)物均未檢測(cè)到，DON的骨架結(jié)構(gòu)完全被破壞，這表明3-epi-DON和另一種代謝產(chǎn)物并不是WSN05-2代謝DON的終產(chǎn)物，而只是兩種中間產(chǎn)物。

3C-OH氧化作用使DON中的3-OH氧化為毒性比DON低的產(chǎn)物DON 3-酮基。Shima等[31]通過(guò)富集培養(yǎng)方法從土壤中篩選得到一株土壤桿菌屬的細(xì)菌E3-39，該菌在30℃厭氧條件下其胞外提取液可將培養(yǎng)基中200 μg/ml的DON代謝掉，代謝產(chǎn)物中70%為3-酮基-DON。V?lkl等[32]從自然界樣品中分離出一株具有將DON降解為3-酮基-DON的細(xì)菌，該菌在20℃條件下保存6個(gè)月仍能保持對(duì)DON的降解能力，該菌代謝DON的代謝產(chǎn)物主要為3-酮基-DON。

本課題組已從74個(gè)土壤、霉變飼料和動(dòng)物腸道食糜樣品中分離出一株高效降解嘔吐毒素的細(xì)菌ANSB714，其發(fā)酵液(活菌數(shù)4.5×109CFU/ml)與初始濃度100 mg/kg的DON反應(yīng)24 h，降解率為97.34%。通過(guò)生理生化和16S rRNA基因序列分析方法鑒定出該菌株為德沃斯氏菌(Devosia sp)。在模擬胃腸道條件下，對(duì)霉變小麥和DDGS中DON降解率分別為86.19%和84.34%。通過(guò)高效液相色譜-二級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定DON降解產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)，推測(cè)菌株德沃斯氏菌ANSB714降解DON的作用機(jī)制，是DON分子上的C3-OH基團(tuán)被氧化為酮基的途徑。降解DON的德沃斯氏菌ANSB714毒理學(xué)和安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果表明：德沃斯氏菌ANSB714對(duì)小鼠經(jīng)口急性毒性LD50大于40 ml/kg體重，對(duì)小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果為陰性，對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

5 嘔吐毒素生物降解研究前景展望

早期報(bào)道的能生物降解嘔吐毒素的微生物大多都是來(lái)源于動(dòng)物腸道的微生物混合物，混合物沒(méi)法進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。也有降解嘔吐毒素單一菌株的報(bào)道，但是這些研究都是用菌株和毒素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行的體外試驗(yàn)，沒(méi)有進(jìn)一步驗(yàn)證其對(duì)飼料嘔吐毒素的降解效果，也沒(méi)有驗(yàn)證其對(duì)動(dòng)物的安全性和有效性，沒(méi)能解決實(shí)際應(yīng)用問(wèn)題。盡管一些動(dòng)物腸道微生物對(duì)嘔吐毒素有降解作用，但是到目前為止，沒(méi)有關(guān)于嘔吐毒素降解酶的研究報(bào)道，也沒(méi)有利用這些微生物或其產(chǎn)生的酶研發(fā)飼料添加劑的相關(guān)報(bào)道。因此，尋找新的高效降解飼料DON的菌株，研究解毒作用機(jī)制，通過(guò)動(dòng)物安全性和有效性評(píng)價(jià)，研究其對(duì)動(dòng)物DON中毒癥的緩解和作用效果，是開發(fā)DON降解菌飼料添加劑的研究基礎(chǔ)。