■李 豐 郝燕娟 葉竹林 賴彩冰 彭志通

（廣州匯標(biāo)檢測(cè)技術(shù)中心，廣東廣州 510300）

魚(yú)粉是全世界使用最廣泛、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富的飼料蛋白原料，其含有動(dòng)物生長(zhǎng)所必需的氨基酸，且含量豐富、配比合理，在飼料、養(yǎng)殖業(yè)行業(yè)中起著不可代替的作用。隨著我國(guó)飼料行業(yè)的發(fā)展，魚(yú)粉需要量逐年增加，由于用量大、價(jià)格高，有些不法商家在魚(yú)粉中摻入水解羽毛粉、血粉、肉骨粉和皮革粉等低價(jià)位的高蛋白質(zhì)弄虛作假、以次充好，使魚(yú)粉質(zhì)量參差不齊。這種現(xiàn)象不但造成資源浪費(fèi)，也為飼料企業(yè)和畜牧業(yè)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)損失。僅用粗蛋白含量作為指標(biāo)，并不能正確反映出魚(yú)粉的質(zhì)量。因此，對(duì)魚(yú)粉中氨基酸含量的測(cè)定有助于魚(yú)粉質(zhì)量的評(píng)價(jià)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，魚(yú)粉及飼料中氨基酸的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法和氨基酸分析儀法，高效液相色譜法是采用鄰苯二甲醛（OPA）、異硫氰酸苯酯（PITC）等衍生化試劑柱前衍生紫外或熒光檢測(cè)，氨基酸分析儀法是采用茚三酮柱后衍生紫外檢測(cè)。采用不同方法同時(shí)測(cè)定魚(yú)粉中氨基酸含量，并對(duì)測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性進(jìn)行比較研究的文章未見(jiàn)發(fā)表。因此，本研究采用OPA、PITC柱前衍生HPLC分析和茚三酮柱后衍生氨基酸分析儀分析三種不同方法測(cè)定魚(yú)粉中16種氨基酸含量，并對(duì)三種方法的結(jié)果進(jìn)行比較，以了解這三種檢測(cè)方法測(cè)定結(jié)果之間的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要儀器

魚(yú)粉樣品為市售進(jìn)口魚(yú)粉；16種氨基酸混標(biāo)（Sigma）；鄰苯二甲醛（Sigma）、異硫氰酸苯酯（Sigma）、茚三酮（Sigma）；乙腈（Merck）、甲醇（Merck）；純凈水（實(shí)驗(yàn)室自制）；其他試劑均為分析純。

日立L-8900氨基酸分析儀，EZChromtion工作站；Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)，包括四元泵、脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器、柱溫箱、Agilent化學(xué)工作站；島津LC-20A高效液相色譜系統(tǒng)，包括二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD檢測(cè)器、柱溫箱、LC-solution工作站；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9030A，上海一恒）；天子天平（EL104，梅特勒）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

酸水解法：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1～0.2 g樣品，置于15 ml安瓿瓶中，加入10 ml 6 mol/l鹽酸溶液，振搖使樣品均勻分散在溶液中，充氮后立即用噴燈熔封，然后置于（110±1）℃烘箱中水解24 h，取出冷卻、過(guò)濾，取水溶液2 ml，置于雞心瓶中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，加入5 ml的0.02 mol/l稀鹽酸溶液溶解，用0.22 μm濾膜過(guò)濾后，取上清液備用。

1.2.2 氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備

精密量取16種氨基酸混標(biāo)（2.5 μmol/ml）適量，用0.02 mol/l鹽酸溶液配制成0.1 μmol/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.3 衍生方法

鄰苯二甲醛衍生法：精密稱(chēng)取鄰苯二甲醛15 mg，加0.4 mol/l硼酸緩沖液1 ml溶解，再加50 μl乙腈和15 μl巰代乙醇酸酯，渦旋混勻，然后采用Agilent 1100高效液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣器的程序進(jìn)樣完成柱前衍生。

異硫氰酸苯酯衍生法：準(zhǔn)確量取水解后溶液和氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作液200 μl，分別置于1.5 ml離心管中，分別加入三乙胺乙腈溶液100 μl和異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μl，搖勻室溫靜置衍生1 h。衍生結(jié)束后分別加入400 μl正己烷，振搖并靜置10 min，取下層溶液用0.45 μm濾膜過(guò)濾后備用。

1.2.4 AAA緩沖液和茚三酮反應(yīng)液的配制

蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)緩沖液（pH-1、pH-2、pH-3、pH-4）、再生液（pH-RG）及茚三酮反應(yīng)液的配制均參考日立L-8900氨基酸分析儀說(shuō)明書(shū)配方。

1.2.5 色譜條件

鄰苯二甲醛衍生法（Agilent HPLC）色譜條件：色譜柱為ZORBAX Eclipse AAA 4.6 mm×150 mm柱；流動(dòng)相A：0.04 mol/l磷酸二氫鈉溶液（pH值7.82）；流動(dòng)相B：甲醇-乙腈-水（45-45-10）溶液，流動(dòng)相洗脫梯度見(jiàn)表1；流速2.0 ml/min，柱溫40℃，波長(zhǎng)338 nm。魚(yú)粉樣品的分離圖譜見(jiàn)圖1。

表1 梯度洗脫程序（OPA）

圖1 魚(yú)粉氨基酸的HPLC圖譜（Agilent HPLC）

異硫氰酸苯酯衍生法（島津HPLC）色譜條件：色譜柱為Sepax AAA 4.6 mm×250 mm柱；流動(dòng)相A：0.1 mol/l醋酸鈉-乙腈（93-7）溶液（pH值6.5）；流動(dòng)相B：乙腈-水（80-20）溶液，流動(dòng)相洗脫梯度見(jiàn)表2；流速1.0 ml/min，柱溫36℃，波長(zhǎng)254 nm。魚(yú)粉樣品的分離圖譜見(jiàn)圖2。

AAA測(cè)定條件：離子交換樹(shù)脂EZChrom Elite 4.6 mm×60 mm柱，時(shí)間51 min，緩沖液流速0.4 ml/min，茚三酮流速0.35 ml/min，緩沖液泵壓8～12 MPa，茚三酮泵壓1.5～3.5 MPa，緩沖液改變次數(shù)3，分離柱溫57℃、衍生柱溫135℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為440 nm和570 nm。魚(yú)粉樣品的分離圖譜見(jiàn)圖3。

表2 梯度洗脫程序（PITC）

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

本研究對(duì)三種方法進(jìn)行的完整的方法學(xué)研究，結(jié)果見(jiàn)表3。AAA法、OPA法和PITC法的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍分別是5～500、10～500 μmol/l和10～500 μmol/l，相關(guān)系數(shù)r均大于0.999；AAA法多數(shù)目標(biāo)物的檢出限低于OPA法，而OPA法的檢出限又優(yōu)于PITC法，主要原因是AAA法的進(jìn)樣體積為20 μl、大于HPLC的5 μl，另PITC法用的是島津HPLC的SPD檢測(cè)器，靈敏度比紫外檢測(cè)器要低一點(diǎn)；在回收率、精密度驗(yàn)證方面，三種方法的結(jié)果都比較相近。

圖2 魚(yú)粉氨基酸的HPLC圖譜（島津HPLC）

圖3 魚(yú)粉氨基酸的AAA圖譜

2.2 測(cè)試結(jié)果的比較

本研究用三種不同方法對(duì)同一個(gè)魚(yú)粉樣品進(jìn)行分析，將測(cè)得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果見(jiàn)表4。三種方法的三列測(cè)定結(jié)果兩兩配對(duì)進(jìn)行線性回歸，得到三個(gè)回歸方程y=0.003 8x+1.004 7，相關(guān)系數(shù)r=0.997 3；y=10.073 4x+1.007 61，相關(guān)系數(shù)r=0.995 3；y=10.094 0x+1.036 1，相關(guān)系數(shù)r=0.998 0。三個(gè)回歸方程的相關(guān)系數(shù)r都是大于0的，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上看三者具有一定的相關(guān)性。對(duì)16種氨基酸測(cè)定結(jié)果采用F檢驗(yàn)，得出的F值見(jiàn)表 4，F(xiàn) 值都小于 F0.95（5，6）4.39，說(shuō)明三種方法的測(cè)定結(jié)果不具有顯著性差異（其中Pro是兩種方法的比較）。三種方法測(cè)定結(jié)果的平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.10%，最大的為6.61%（Pro），最小的為0.91%（Thr），其中國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)魚(yú)粉兩個(gè)重要氨基酸指標(biāo)蛋氨酸、賴氨酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.11%和2.17%。

表3 方法學(xué)比較

表4 樣品實(shí)測(cè)值比較

2.3 三種方法的比較分析

本研究采用的OPA法（Agilent HPLC）和PITC法（島津HPLC）是相應(yīng)儀器供應(yīng)商根據(jù)各自儀器的特點(diǎn)推薦的柱前衍生方法。OPA衍生步驟簡(jiǎn)單、反應(yīng)速度快，只需設(shè)置儀器程序進(jìn)樣就能完成柱前衍生步驟，OPA能和一級(jí)氨基酸發(fā)生衍生反應(yīng)，不能和二級(jí)氨基酸直接反應(yīng)，所以本研究中OPA法沒(méi)有測(cè)定脯氨酸含量。有文獻(xiàn)報(bào)道，可以采用OPA和氯甲酸芴甲酯（FMOC）兩種衍生試劑結(jié)合衍生、FMOC與二級(jí)氨基酸衍生的辦法解決OPA法的缺陷，不過(guò)這種方法可能會(huì)使反應(yīng)條件的選擇難度增大，同時(shí)也會(huì)對(duì)后續(xù)的分離帶來(lái)更大的困難。PITC與一級(jí)、二級(jí)氨基酸均能反應(yīng)，只是PITC法具有衍生反應(yīng)條件嚴(yán)格、步驟相對(duì)復(fù)雜、毒性大、會(huì)降低分析柱壽命等缺陷。AAA法采用的是茚三酮在線柱后衍生，衍生反應(yīng)迅速、穩(wěn)定。

本研究采用了三種不同儀器，運(yùn)用常規(guī)前處理酸水解法測(cè)定了魚(yú)粉中16種氨基酸（OPA法測(cè)定15種）的含量。色氨酸在酸中分解，如采用酸水解法無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定色氨酸的含量，必須采用堿水解法。半胱氨酸中的巰基會(huì)同OPA法中的2-巰基乙醇發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)，所以O(shè)PA法無(wú)法測(cè)定半胱氨酸含量。針對(duì)這兩種情況，本研究未檢測(cè)魚(yú)粉中色氨酸和半胱氨酸含量，在后續(xù)工作中將對(duì)這兩種氨基酸的含量測(cè)定進(jìn)一步研究。

有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定飼料中氨基酸的檢測(cè)要使用氨基酸分析儀，不過(guò)氨基酸分析儀在價(jià)格上比高效液相色譜儀貴，對(duì)于需要出具公證數(shù)據(jù)、仲裁服務(wù)的檢測(cè)機(jī)構(gòu)可能會(huì)采用氨基酸分析儀測(cè)定氨基酸，其他企業(yè)實(shí)驗(yàn)室、研究機(jī)構(gòu)等針對(duì)價(jià)格和多用性可能會(huì)考慮高效液相色譜儀測(cè)定氨基酸。使用者可根據(jù)不同需求選擇合適的檢測(cè)儀器和衍生方法。

3 結(jié)論

從本研究結(jié)果可看出，AAA法檢出限最低，回收率、精密度三種方法都比較相近。三種方法都可以測(cè)定魚(yú)粉中氨基酸的含量，其測(cè)定結(jié)果具有相關(guān)性，且結(jié)果不具有顯著性差異，但存在一定的偏差。

（參考文獻(xiàn)若干篇，刊略，需者可函索）