■湯海鷗 高秀華 姚 斌 張廣民 王振興 孔祥書(shū)

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2.生物飼料開(kāi)發(fā)國(guó)家工程研究中心，北京 100081；3.河南省黃泛區(qū)鑫欣牧業(yè)有限公司，河南黃泛區(qū) 466632）

外界環(huán)境的變化及攝入食物可能影響動(dòng)物腸道中微生物菌群的平衡，造成有害菌群生長(zhǎng)和腹瀉等消化道疾病，引起畜禽類(lèi)動(dòng)物消化道疾病常見(jiàn)的病源微生物主要有大腸桿菌和沙門(mén)氏菌等。傳統(tǒng)預(yù)防胃腸道疾病多以在飼料中添加抗生素類(lèi)藥物，抗菌藥在動(dòng)物上的長(zhǎng)期大量使用，易引起機(jī)體胃腸功能紊亂，使耐藥菌株增加。因此，世界各國(guó)都開(kāi)展著對(duì)抗生素替代物的研究。葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOD）是一種能夠催化葡萄糖被分子氧或原子氧氧化為葡萄糖酸內(nèi)酯和過(guò)氧化氫的氧化還原酶，其中葡萄糖酸內(nèi)酯可以自發(fā)水解成為葡萄糖酸，具有類(lèi)似酸化劑的作用，過(guò)氧化氫具有廣譜殺菌作用，可以起到抑制大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等致病微生物生長(zhǎng)繁殖的作用[1-2]，1999年GOD就已被列入農(nóng)業(yè)部飼料添加劑品種目錄中規(guī)定可以添加使用的飼用酶制劑之一，本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)基因克隆技術(shù)在畢赤酵母生物反應(yīng)器中進(jìn)行高效表達(dá)，采用液體深層發(fā)酵方式使GOD酶活水平達(dá)到了615 U/ml，大大降低了生產(chǎn)成本[3]。前期試驗(yàn)研究表明，GOD能有效地改善單胃動(dòng)物胃腸道健康，提高畜禽的生長(zhǎng)性能[4-5]。然而，GOD在動(dòng)物生產(chǎn)上發(fā)揮效果的具體抑菌、產(chǎn)酸功能，并未見(jiàn)有具體的體外驗(yàn)證試驗(yàn)文獻(xiàn)報(bào)道。鑒于此，本試驗(yàn)通過(guò)單層平板擴(kuò)散試驗(yàn)和pH值測(cè)定試驗(yàn)研究GOD對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌的體外抑菌效果和產(chǎn)酸能力，探討GOD在動(dòng)物生產(chǎn)上發(fā)揮效果的作用機(jī)理，為GOD在畜牧業(yè)上的廣泛應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)酶菌

試驗(yàn)用飼用葡萄糖氧化酶產(chǎn)品由農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，酶活含量大于1 000 U/g（酶活定義為：在37℃、pH值為5.5的條件下，每分鐘內(nèi)從過(guò)量底物中降解釋放1 μmol產(chǎn)物所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位，即1 U）；致病性大腸桿菌、沙門(mén)氏菌購(gòu)自于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

BCL-1360A型潔凈工作臺(tái)，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；LDZX-50型高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DGP-9057B-2型培養(yǎng)箱/干燥箱，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HZQ-X100型振蕩培養(yǎng)箱，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；150 mm型游標(biāo)卡尺，上海力成五金工具有限公司；FE20型實(shí)驗(yàn)pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 溶液、培養(yǎng)基及配制方法

1.2.1 營(yíng)養(yǎng)瓊脂配制

蛋白胨 1.0 g、酵母粉 0.5 g、NaCl 0.9 g、瓊脂粉1.5 g，加蒸餾水100 ml，混勻并充分溶解，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻到55℃左右傾注平皿，待培養(yǎng)基凝固后倒置，置37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，合格后置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩I(yíng)養(yǎng)肉湯成分相同，只是不加瓊脂粉，分裝到試管后再進(jìn)行滅菌。

1.2.2 底物葡萄糖溶液（GS）

根據(jù)需要，取不同量葡萄糖，溶于去離子水，定容至100 ml，搖勻后即可使用。

1.2.3 乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（0.1 mol/l，pH值5.5）

稱(chēng)取三水乙酸鈉11.57 g，加入冰乙酸0.85 ml。再加水溶解，定容至1 000 ml，測(cè)定溶液的pH值。如果pH值偏離5.5，再用乙酸溶液或乙酸鈉溶液（0.1 mol/l乙酸溶液：吸取冰乙酸0.60 ml，加水溶解，定容至100 ml；0.1 mol/l乙酸鈉溶液：稱(chēng)取三水乙酸鈉1.36 g。加水溶解，定容至100 ml）調(diào)節(jié)至5.5。

1.2.4 生理鹽水

取NaCl 9.0 g，加蒸餾水1 000 ml，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后冷卻待用。

1.3 抑菌、產(chǎn)酸試驗(yàn)操作方法

1.3.1 不同濃度葡萄糖溶液和GOD溶液抑菌試驗(yàn)方法

用滅菌水配制成含有葡萄糖0、0.062 5、0.125、0.25 g/ml的溶液，用滅菌乙酸鹽緩沖液（pH值5.5）配制成含GOD 0、12.5、25、50 U/ml的溶液，分別采用牛津杯抑菌試驗(yàn)方法，在牛津杯中加入試驗(yàn)溶液270 μl，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，以抑菌圈清晰為好，測(cè)定抑菌圈直徑，以毫米（mm）為單位。每個(gè)樣品做3平行板。以下同。

1.3.2 牛津杯大腸桿菌抑菌試驗(yàn)操作方法

將培養(yǎng)好的大腸桿菌用無(wú)菌生理鹽水稀釋成濃度約為107CFU/ml的菌液，吸取100 μl涂布于制備好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，然后再等距離地放置滅菌好的牛津杯，靜置5 min。取配置好的50 U/ml GOD 1.0 ml與0.1 g/ml（10%）GS 1.0 ml等體積混合，混合液再用滅菌乙酸緩沖液（pH值5.5）稀釋成含GOD 25、12.5、6.25、3.125 U/ml的溶液，37 ℃反應(yīng)10 min后，取混合溶液270 μl加入牛津杯。

1.3.3 不同溫度處理下GOD抑制大腸桿菌試驗(yàn)方法

分別取10.0 g GOD樣品置于不同溫度干熱處理10 min，然后將處理過(guò)的GOD取適量全部配制成GOD濃度為50 U/ml的溶液，將50 U/ml的GOD 1.0 ml與0.09 g/ml（0.5 mol/l）GS 1.0 ml等體積混合，混合液含GOD 25 U/ml，37 ℃反應(yīng)10 min后，采用“1.3.2”牛津杯抑菌試驗(yàn)方法，取混合溶液270 μl加入牛津杯。

1.3.4 牛津杯沙門(mén)氏菌抑菌試驗(yàn)操作方法

將培養(yǎng)好的沙門(mén)氏菌用無(wú)菌生理鹽水稀釋成濃度約為107CFU/ml的菌液，吸取100 μl涂布于制備好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，然后再等距離地放置上滅菌的牛津杯，靜置5 min。取粉末型GOD 1.0 g溶解于100 ml滅菌乙酸鹽緩沖液中，GOD濃度為10 U/ml，然后用滅菌乙酸緩沖液分別稀釋成含GOD 5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 U/ml的溶液，6種濃度的酶液分別取1.0 ml酶液與0.1 g/ml（10%）GS 1.0 ml等體積混合，混合液GOD濃度則相應(yīng)稀釋為5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 U/ml，37 ℃反應(yīng)10 min后，取混合溶液270 μl加入牛津杯，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，以抑菌圈清晰為好，測(cè)定抑菌圈直徑。每個(gè)樣品做3平行板。

1.3.5 GOD體外產(chǎn)酸試驗(yàn)操作方法

用FE20型實(shí)驗(yàn)pH計(jì)測(cè)定初始配制好的葡萄糖溶液pH值，記為起始值。加入適量GOD樣品后，置于恒溫振蕩箱39℃、150 r/min振蕩。0.2 g GOD加入100 ml 20%（0.2 g/ml）GS溶液中，溶液中GOD酶活為1.0 U/ml。每隔1 h測(cè)量溶液pH值。每個(gè)樣品做3平行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，應(yīng)用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行差異顯著性分析，采用LSD法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 GOD對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，分別加入不同濃度葡萄糖或GOD溶液的結(jié)果表明所有試驗(yàn)樣品都未見(jiàn)抑菌圈。

不同濃度和溫度處理下，GOD混合液抑制大腸桿菌和沙門(mén)氏菌試驗(yàn)結(jié)果如表2、3、4。隨著GOD濃度的逐倍降低，對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌圈直徑相應(yīng)也逐漸變小，且有些濃度之間出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。在65℃溫度處理下的GOD對(duì)大腸桿菌抑菌圈與常溫對(duì)照組未出現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05），但在高于65℃條件下抑菌圈結(jié)果隨著溫度升高出現(xiàn)逐步降低的趨勢(shì)，高溫影響了GOD的抑菌效果，且65℃與75℃之間有顯著性差異（P＜0.05）。

表2 不同濃度GOD混合液對(duì)大腸桿菌抑菌試驗(yàn)結(jié)果

表3 不同溫度處理GOD對(duì)大腸桿菌抑菌試驗(yàn)結(jié)果

表4 不同濃度GOD混合液對(duì)沙門(mén)氏菌抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.2 GOD體外產(chǎn)酸對(duì)pH值的影響（見(jiàn)表5）

表5 GOD混合液隨時(shí)間pH值變化結(jié)果

由表5可知，隨著時(shí)間的變長(zhǎng)，GOD產(chǎn)酸效果越明顯，pH值從最初的5.61降低到3.03，呈逐漸降低趨勢(shì)，且部分結(jié)果之間有顯著性差異（P＜0.05）。

3 討論

大腸桿菌和沙門(mén)氏菌都是動(dòng)物腸道中常見(jiàn)的有害菌，GOD在以葡萄糖為底物進(jìn)行反應(yīng)的過(guò)程中，一方面通過(guò)與葡萄糖作用而產(chǎn)生的葡萄糖酸來(lái)發(fā)揮降低pH值作用，酸性環(huán)境有利于乳酸桿菌等有益菌的生長(zhǎng)繁殖，對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等有害菌有抑制作用。黃建華等[6]研究了二甲酸鉀對(duì)斷奶仔豬大腸桿菌和乳酸桿菌的影響，結(jié)果表明二甲酸鉀添加降低了斷奶仔豬新鮮糞樣中大腸桿菌數(shù)。另一方面，反應(yīng)產(chǎn)生的少量過(guò)氧化氫能起到抑菌殺菌的作用，動(dòng)物上的應(yīng)用可有效改善消化道健康。楊久仙等[7]研究GOD對(duì)斷奶仔豬胃腸道微生物區(qū)系以及生產(chǎn)性能的影響，結(jié)果顯示與對(duì)照相比，飼糧中添加GOD提高了仔豬日增重，降低了消化道內(nèi)大腸桿菌數(shù)量。GOD在反應(yīng)過(guò)程中同時(shí)會(huì)消耗氧氣，更易形成厭氧環(huán)境，大多數(shù)的有益菌是厭氧菌、有害菌是需氧菌，厭氧環(huán)境的形成更利于抑制腸道有害菌，促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)。筆者早期研究表明[5]，飼糧中添加GOD使仔豬糞便中沙門(mén)氏菌數(shù)顯著低于對(duì)照組。從本試驗(yàn)結(jié)果可知，葡萄糖或者GOD在無(wú)底物葡萄糖存在的情況下瓊脂板上無(wú)抑菌圈產(chǎn)生，只有當(dāng)添加有底物葡萄糖時(shí)GOD才能發(fā)揮有效的抑菌效果。GOD對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌抑菌圈直徑都大于常用抗菌藥物敏感性試驗(yàn)敏感度抑菌圈最低值（10～12 mm），這說(shuō)明GOD對(duì)動(dòng)物腸道內(nèi)常見(jiàn)的大腸桿菌和沙門(mén)氏菌有較好的抑菌效果。GOD的產(chǎn)酸效果對(duì)pH值起到了很大降低作用。

4 結(jié)論

不同濃度和溫度處理下，GOD混合液對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌有較好的抑制效果；隨著時(shí)間的變長(zhǎng)，GOD產(chǎn)酸效果越明顯。