劉新結(jié) 夏開群

缺血性腎臟病是指超過管腔的60%腎動(dòng)脈重度狹窄或阻塞，腎臟嚴(yán)重缺血導(dǎo)致的慢性進(jìn)行性腎臟病[1]。老年人腎動(dòng)脈狹窄主要由動(dòng)脈粥樣硬化病引起，故臨床上狹義“缺血性腎病”特指腎動(dòng)脈粥樣硬化所致缺血性腎臟病。腎缺血嚴(yán)重會(huì)導(dǎo)致腎缺血性高血壓，會(huì)給患者帶來極大的痛苦，因此在臨床醫(yī)學(xué)上對(duì)腎缺血的研究較多。本研究針對(duì)大鼠腎缺血采用烏司他丁等進(jìn)行治療，并取得不錯(cuò)的效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取40只健康雄性SD大鼠，大鼠的體質(zhì)量在250～300g之間，由某動(dòng)物研究中心提供，將所有的大鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組（n=20），確保40只大鼠均為雄性且沒有其它疾病，保證樣本的可研究性。

在準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)使用的SOD和MDA測(cè)試盒，編號(hào)分別為A001和A003，由南京建成生物工程研究所提供的，需要準(zhǔn)備蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，編號(hào)A045-2，準(zhǔn)備廣州天普升華醫(yī)藥股份有限公司的批號(hào)為02051102的醫(yī)用烏司他丁等實(shí)驗(yàn)需要用的實(shí)驗(yàn)器材和醫(yī)用試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 將所有的大鼠注射3mL的10%的水合氯醛進(jìn)行麻醉，然后夾閉大鼠雙側(cè)的腎蒂，并且持續(xù)45min，然后再灌注腎臟I/R模型，持續(xù)6h，需要注意的是，夾腎蒂的要使用無損傷動(dòng)脈，當(dāng)腎臟的顏色變暗時(shí)腎臟的血流則被阻斷，通常情況下，45min之后松開動(dòng)脈夾，腎臟恢復(fù)到鮮紅血色表示腎臟血流恢復(fù)，在此過程中，需要注射2次20mL的林格液[2]。其中，對(duì)照組在持續(xù)45min的完全血流不流通之前，先夾閉大鼠雙側(cè)腎蒂保持5min的缺血狀態(tài)，再灌注5min，如此反復(fù)3次，再使得腎臟血流恢復(fù)。而實(shí)驗(yàn)組在缺血前30min從大鼠的尾巴靜脈注射烏司他丁，劑量為2×104μ/kg，剩余操作2組相同。

分別灌注6h后進(jìn)行開腹手術(shù)取出腎臟，將腎臟固定在濃度為10%的福爾馬林中，再制作石蠟切片準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)，使用酶法測(cè)定血清肌配(Cr)含量、苦味酸不除蛋白法測(cè)定尿素氮含量和終點(diǎn)法測(cè)定尿酸(UA)的濃度；使用放射性分析法測(cè)定尿α1-MG和β2-MG的含量；硫代巴比妥酸法測(cè)定腎組織中丙二醛含量和黃嚓吟氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶活性；采用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)腎組織Bcl-2mRNA以及Bax mRNA表示，然后計(jì)算腎小管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)；采用免疫組化法觀察腎組織中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)，計(jì)算蛋白陽(yáng)性染色指數(shù)；蘇素-伊紅染色，在光鏡下觀察腎組織病理學(xué)變化[3]。

1.3 觀察指標(biāo) 按照已知的陽(yáng)性標(biāo)本為標(biāo)準(zhǔn)，一抗作陰性對(duì)照使用生理鹽水，陽(yáng)性染色細(xì)胞顯現(xiàn)棕黃色，使用光鏡找出病變嚴(yán)重部位觀察HE染色切片，1個(gè)視野觀察10個(gè)腎小管，共觀察100個(gè)腎小管，按照Paper法評(píng)分：如果腎小管出現(xiàn)明顯擴(kuò)張，并且細(xì)胞扁平，則評(píng)1分；腎小管出現(xiàn)管型則評(píng)2分；如果腎小管腔內(nèi)出現(xiàn)脫落的現(xiàn)象，并且出現(xiàn)壞死的細(xì)胞，最后出現(xiàn)成管型或細(xì)胞碎片的情況評(píng)1分；上皮細(xì)胞顆粒出現(xiàn)變性現(xiàn)象的評(píng)1分；空泡變性評(píng)1分，細(xì)胞核固縮評(píng)4分，心臟取血，離心，取血清，－20℃冰箱保存，測(cè)定尿素氮(BUN)和肌醉(Cr)濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件對(duì)本次研究數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2進(jìn)行檢驗(yàn)，計(jì)量資料以“x±s”記錄，并采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

對(duì)照組處理大鼠腎臟缺血有一定改善，實(shí)驗(yàn)組改善較為顯著，使用烏司他丁聯(lián)合缺血前后處理，Cr和BUN濃度顯著升高，α1-MG和β2-MG含量顯著增加，因此對(duì)大鼠腎缺血使用烏司他丁、缺血預(yù)處理聯(lián)合缺血后處理效果更加顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 1。

表1 2組大鼠處理前后各項(xiàng)指標(biāo)改善情況（±s）

表1 2組大鼠處理前后各項(xiàng)指標(biāo)改善情況（±s）

組別 時(shí)間 Cr（μmg/L）β2-MG（mg/L）對(duì)照組 處理前 51±4 4.7±1.0 7.2±3.3 7.6±3.4處理后 58±3 9.8±0.7 27.4±6.3 28.5±5.9實(shí)驗(yàn)組 處理前 52±3 4.8±0.9 7.3±3.2 7.5±3.3處理后 70±5 11.7±1.8 43.5±7.0 40.5±9.7 BUN(mol/L)α1-MG（mg/L）

3 討論

本研究結(jié)果顯示，腎I/R損傷程度明顯，大鼠腎功能受損嚴(yán)重，但烏司他丁減輕了腎小管上皮細(xì)胞的變性和壞死，對(duì)大鼠腎I/R損傷起到了保護(hù)作用。

烏司他丁是一種廣譜蛋白酶抑制劑，臨床上主要用于治療急性胰腺炎及多種休克及手術(shù)侵襲所引起的并發(fā)癥，烏司他丁的保護(hù)機(jī)制與抗氧化作用、抑制氧自由基生成、清除氧自由基，從而增加腎小球和小管細(xì)胞的細(xì)胞膜及線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等細(xì)胞器的膜穩(wěn)定性、減輕自由基引起的腎組織損傷與改善細(xì)胞能量代謝可能有關(guān)[4]。烏司他丁分子中具有多種酶的結(jié)合位點(diǎn)，能同時(shí)獨(dú)立抑制多種酶的活性，對(duì)缺血再灌注損傷中各種炎性介質(zhì)的釋放有明顯抑制作用，并具有穩(wěn)定溶酶體膜，抗氧化和清除氧自由基以及內(nèi)毒素的作用，改善微循環(huán)和組織灌注，還有利尿、抗休克作用。一系列的臨床和實(shí)驗(yàn)研究已表明，烏司他丁可抑制各種原因的腎損害[5]。

熱休克蛋白是生物在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中所保存下來的一組細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，當(dāng)受到相關(guān)刺激后就會(huì)增加，比如受熱、病原體和缺血缺氧等因素，會(huì)增加細(xì)胞的耐受力等在研究腎小管上皮細(xì)胞死亡的影響時(shí)，以缺氧對(duì)大鼠腎缺血損傷的情況為例，發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白明顯增加，HSP 70在一定條件下能對(duì)腎臟缺血造成損傷。Bcl-2是哺乳細(xì)胞中第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)與線蟲的抑制細(xì)胞凋亡的原癌基因具有較高的同源性[6]。Bc1-2過量可引起細(xì)胞凋亡，Bcl-2蛋白在UR前后有一定變化，但在缺血前后沒有明顯差異。有研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2蛋白可以降低自由基活性和抑制氧自由基生成發(fā)揮搞氧化作用，還能維持線料體的氧化功能。說明烏司他丁可能通過影響腎小管上皮細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)增加膜穩(wěn)定性作用，但是還需要進(jìn)一步研究[7]。

綜上所述，烏司他丁對(duì)腎臟缺血損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)腎臟bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)，大鼠腎缺血使用烏司他丁、缺血預(yù)處理聯(lián)合缺血后處理效果更加顯著。部分復(fù)雜的腎臟手術(shù)中阻斷腎臟血流會(huì)引起腎缺血損傷[8]；在常溫下阻斷腎臟血流時(shí)間超過40min，會(huì)導(dǎo)致急性腎功能衰竭，移植腎早期功能對(duì)長(zhǎng)期存活有重要的影響。

[1] 范玲玲,侯明星,都義日,等．烏司他丁對(duì)腸缺血-再灌注損傷大鼠血清SOD活性及MDA水平的影響[J]．山東醫(yī)藥,2014,32(10)：39-40．

[2] 錢小英,金曉盛,邵美琴,等．烏司他丁聯(lián)合維拉帕米在大鼠急性肺缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用[J]．中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2014,31(5)：1054-1056．

[3] 李廣罡,鄭濤．烏司他丁對(duì)大鼠缺血-再灌注肝臟Toll樣受體表達(dá)的影響[J]．中國(guó)急救醫(yī)學(xué),2013,33(6)：554-556．

[4] 段志學(xué)．烏司他丁加甲基潑尼松龍對(duì)大鼠急性壞死性胰腺炎血清淀粉酶及細(xì)胞因子的影響[J]．當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2010,16（12）：30-31．

[5] 邵壯,熊江,郭偉,等．烏司他丁對(duì)大鼠肢體缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制[J]．臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2014,35(10)：777-781．

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[7] 駱喜寶,潘云,陳燕,等．烏司他丁對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠凝血功能及血小板的影響[J]．廣東醫(yī)學(xué),2013,34(1)：40-42．

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