膿毒癥實驗動物模型的研究進展

郭松喜1王丹2劉春生3

張睢揚1王英1

作者單位： 100000 北京，第二炮兵總醫(yī)院呼吸科1、藥劑科2、骨科3

【關(guān)鍵詞】膿毒癥;動物模型;微透析技術(shù)

膿毒癥(sepsis)是指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，盡管近年來抗生素治療取得了新的進展，但膿毒癥病死率仍呈現(xiàn)不斷上升的趨勢[1]。究其原因是我們?nèi)圆荒軐δ摱景Y的發(fā)生發(fā)展有一個準確的監(jiān)測。制備與膿毒癥疾病高擬合度的動物模型至關(guān)重要，精準、動態(tài)的取樣技術(shù)與監(jiān)測方法亦不可或缺，例如微透析(microdialysis, MD)技術(shù)[2]?，F(xiàn)就近十年來膿毒癥動物模型的研究進展做一綜述。

一、膿毒癥動物模型的基本要求

根據(jù)膿毒癥的發(fā)病因素、病理生理學(xué)變化以及臨床特征，膿毒癥動物模型必須具備以下基本要素：①有膿毒癥典型的高排低阻血流動力學(xué)表現(xiàn)和高代謝狀態(tài)；②伴發(fā)多個器官功能障礙；③有較高的自然死亡率，根據(jù)膿毒癥的轉(zhuǎn)歸，要求動物模型的自然死亡率達到50%～70%；④膿毒癥是嚴重感染引起機體的炎癥反應(yīng)過度激活造成的自身損傷，不是細菌和內(nèi)毒素對機體的直接損傷，故出現(xiàn)器官功能障礙及動物死亡距膿毒癥模型制備應(yīng)有一定的時間間距。一般在制模后6～12 h后發(fā)生的器官功能障礙或死亡屬全身炎癥反應(yīng)所致[3]。

二、常用的膿毒癥模型

1.盲腸結(jié)扎一穿孔(cecal ligation and puncture, CLP)： 按預(yù)先設(shè)計好的嚴重程度結(jié)扎不同位置的盲腸，然后刺穿盲腸(或者用絲線縫穿盲腸并將絲線線圈留置)并將盲腸回納，連續(xù)縫合關(guān)腹即可完成CLP模型的制作。CLP膿毒癥模型被認為是研究膿毒癥潛在機制的理想模型，主要優(yōu)點之一是能夠誘導(dǎo)不同嚴重程度的膿毒癥[4]。膿毒癥的嚴重程度與盲腸結(jié)扎長度、穿孔針的大小和穿孔數(shù)量等有關(guān)。Huber-Lang等[5]使用CLP方法成功制造了膿毒癥和膿毒癥休克模型，研究發(fā)現(xiàn)與單純的實行CLP操作及單獨阻斷白細胞分化抗原14(cluster of differentiation 14, CD14)或者補體C5(complement C5)相比，雙阻斷CD14和補體C5可以明顯提高膿毒癥大鼠的生存率，特定的阻斷CD14和補體C5或許可以作為治療膿毒癥的一種新策略。Wu等[6]研究發(fā)現(xiàn)在CLP組，肝臟及肺泡上皮細胞顯示腫脹、變性、壞死及嗜酸性粒細胞浸潤，而在人參皂苷Rb1(ginsenoside Rb1)組則顯示輕度變性及嗜酸性粒細胞浸潤，但是沒有壞死，這也許是人參皂苷Rb1通過改善動脈血壓、下調(diào)Toll樣受體4信使核糖核酸(Toll-like receptor 4 Messenger RNA，TLR4 mRNA)的表達及阻止腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的生成起到保護膿毒癥大鼠的肝臟和肺臟免受損害，提高了其生存率。

2. 腹腔細菌接種: Ahernholz等采用纖維蛋白-糞便凝塊，將其種植到腹腔，既能防止糞便中的細菌被過快吸收，又能使細菌持續(xù)性釋放入血，避免了大量細菌進入腹腔迅速彌散而產(chǎn)生中毒性休克。這種方法制作的模型雖然可產(chǎn)生類似膿毒癥患者的細胞因子反應(yīng)，但很少發(fā)生器官功能障礙和血液動力學(xué)改變。為此，有人在纖維蛋白-糞便凝塊模型的基礎(chǔ)上，增加腸道缺血—再灌注進行二次打擊，制作嚴重膿毒癥和器官損害模型。楊景程等[7]通過在腹腔注射熱滅活細菌菌液制造小鼠膿毒癥模型，實驗觀察了中藥活性成分苦柯胺B(kukoamine B, KB)體內(nèi)外拮抗膿毒癥的藥理活性，得出苦柯胺B作為一種多病原分子的中和劑，能夠抑制炎癥介質(zhì)的釋放，發(fā)揮對膿毒癥模型小鼠的保護作用，且效果顯著優(yōu)于現(xiàn)有臨床用藥血必凈和烏司他丁。

3. 腹腔注射人糞便懸液: Connert等[8]改良了人糞便懸液腹腔注射法。收集并混合健康非素食人的糞便，迅速將其與預(yù)先配置的巰基乙酸鹽懸液按1︰1體積稀釋以優(yōu)化細菌生長，加入過氧化氫酶( 0.19 mg/100 ml) 以滅活活性氧。懸液中加入10%甘油，厭氧條件下勻漿。然后將處理好的人糞便懸液按實驗?zāi)康慕?jīng)大鼠右下腹腹腔注射。Swarbreck等[9]通過腹腔注射人糞便懸液建立了膿毒癥小鼠模型，研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥了增加所有體液和器官中細菌的含量、纖溶酶原激活劑抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)的信使核糖核酸含量以及肺和肝中的酶活性。膿毒癥可增加肺及肝中髓過氧化物酶的水平，但在脾中卻降低。因此，抗壞血酸鹽對膿毒癥小鼠骨骼肌毛細血管堵塞的快速反應(yīng)并不伴隨著PAI-1改變或髓過氧化物酶反應(yīng)而發(fā)生。

4. 細菌或內(nèi)毒素血癥模型: 膿毒癥是細菌及其細胞壁主要成分—脂多糖(lipopoly saccharide, LPS)釋放入血導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)。理論上，靜脈注射細菌或LPS能引起機體炎癥介質(zhì)釋放，模擬急性全身炎癥反應(yīng)的癥狀。根據(jù)輸注細菌或加內(nèi)毒素的速度和量可以分為3種：大劑量單次輸注、小劑量單次輸注和小劑量持續(xù)輸注。小劑量單次輸注所制作的模型器官功能損害可能不明顯，死亡率低，不符合膿毒癥的預(yù)后規(guī)律。同單次輸注致死量(大劑量單次輸注)的模型相比，持續(xù)小劑量注射法模型的促炎細胞因子腫瘤壞死因子呈低水平升高，但維持時間長，動物長時間地呈現(xiàn)高排低阻的血液動力學(xué)變化和高代謝狀態(tài)，與膿毒癥患者的病理生理和臨床表現(xiàn)較為相似。陳明祺等[10]通過持續(xù)小劑量靜脈注射脂多糖(LPS，5 mg/kg)建立膿毒癥模型，研究了膿毒癥小鼠的炎癥反應(yīng)及免疫功能。病理切片表明在LPS輸注2 h后模型組及四逆湯組均出現(xiàn)腸黏膜中炎癥細胞嚴重浸潤，絨毛嚴重破壞，而12 h后四逆湯組較模型組炎癥細胞浸潤有所減輕，腸絨毛的修復(fù)亦較明顯。得出四逆湯可以調(diào)節(jié)全身炎癥反應(yīng)系統(tǒng)，促進膿毒癥小鼠的腸黏膜、腸道功能及免疫狀態(tài)的修復(fù)。Skorup等[11]通過持續(xù)小劑量靜脈注射大腸桿菌建立了豬的膿毒癥模型，研究表明對于革蘭陰性菌感染的嚴重膿毒癥或膿毒癥休克的早期階段，在內(nèi)酰胺類抗生素的基礎(chǔ)上聯(lián)合一種氨基糖苷類抗生素能增強抗菌作用。

5. 燒傷膿毒癥: 燒傷膿毒癥及其誘發(fā)的膿毒性休克和多器官功能障礙綜合征，已成為燒傷患者死亡的主要原因之一，因此，膿毒癥的早期診斷對其治療有重要意義。Shi等[12]制造了燒傷加綠膿桿菌感染的膿毒癥模型，得出銀耳多糖可以抑制燒傷加綠膿桿菌感染的膿毒癥小鼠CD4(+)CD25高表達調(diào)節(jié)細胞的異?；顒?，至少可以減少白細胞介素10(interleukin-10, IL-10)的分泌，并能夠激發(fā)活化的 CD4(+)T 細胞Th2向Th1的轉(zhuǎn)變。此外，銀耳多糖能明顯降低燒傷膿毒癥小鼠的死亡率。

6. 腹膜炎膿毒癥: Melo等[13]通過向小鼠腹腔注射糞便制造了自發(fā)性腹膜炎，并觀察了腹膜炎進展至膿毒癥的過程，得出對于沒有永久雙邊頸動脈閉塞(permanent bilateral carotid occlusion, PBCO)的年幼大鼠，靜脈注射莫西沙星及地塞米松治療嚴重糞便腹膜炎是非常有效的，對于合并有PBCO，甚至是腹腔和胸腔有殘存膿腫的老年大鼠亦能達到一定的效果。陳海鳴等[14]通過升結(jié)腸支架置入制造了腹膜炎模型，得出其操作簡單，具有可重復(fù)性，可以模仿人類彌漫性腹膜炎疾病過程，適用于外科膿毒癥的研究。并且升結(jié)腸支架置入腹膜炎模型可以模擬臨床上患者腸瘺的病理生理變化，由早期出現(xiàn)的體溫下降，白細胞及炎癥因子增高及菌血癥反應(yīng)，最終引起致死性膿毒癥反應(yīng)。

7. 其他: 膿毒癥常見靶部位有肺、腎、骨髓、血液系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、膽道系統(tǒng)等，根據(jù)實驗?zāi)康倪€有很多制造膿毒癥的方法，例如：Maybauer等[15]在氣管切開造口處灌輸銅綠假單胞菌制造了羊嚴重膿毒癥模型，研究了選擇性血管加壓素1型受體激動劑對嚴重膿毒癥的作用，得出膿毒癥復(fù)蘇時使用選擇性抗利尿激素1a型受體激動劑比1a型受體激動劑和V2型受體激動劑的混合劑能更有效防止血管阻塞。Hestenes等[16]在完成內(nèi)側(cè)胸骨切開術(shù)后，向其內(nèi)注射了大腸桿菌，建立了豬膿毒癥模型，探討了嚴重膿毒癥的心肌功能障礙，研究表明張力超聲心動圖可以在射血分數(shù)和心輸出量顯著變化之前反映心肌功能障礙，其有望成為臨床評估膿毒癥的一項有用工具。

三、膿毒癥動物模型評價指標

1. 膿毒癥成模標準: 動物出現(xiàn)發(fā)熱，心率、呼吸頻率明顯加快，口鼻腔分泌物增多，精神萎靡，嗜睡，蜷縮，豎毛，少動，拒食或少食，眼角出現(xiàn)分泌物，血培養(yǎng)陽性等為模型成功。膿毒癥標準加上至少一個器官功能障礙為嚴重膿毒癥成模標準。

2. 監(jiān)測指標

(1)血標本檢測：

① C-反應(yīng)蛋白(C-Reactive Protein，CRP)：對于膿毒癥的早期診斷及預(yù)后評估有重要價值。Park等[17]研究發(fā)現(xiàn)對于伴有腎功能損傷的膿毒癥患者，CRP可作為一個準確的感染指標。雖然檢測降鈣素原(procalcitionin, PCT)的花費要比CRP高，但是作為炎癥指標，PCT的診斷價值并不優(yōu)于CRP。Alkhamis等[18]發(fā)現(xiàn)術(shù)前CRP水平是預(yù)測腫瘤患者發(fā)生膿毒癥的一個可靠指標。

② 血清PCT：可作為早期鑒別全身感染及判斷膿毒血癥嚴重程度及預(yù)后的有效指標。研究表明，PCT診斷膿毒癥有較好的敏感性和特異性，PCT<5.0 ng/ml對于膿毒癥有足夠的排除標準[19]。血漿中PCT濃度的升高不僅可以判斷是否存在全身細菌感染，而且可以反映感染的嚴重程度。Huang等[20]發(fā)現(xiàn)，PCT≥10.0 mg/L時，致病菌為革蘭陰性菌的幾率比革蘭陽性菌的幾率大。雖然血清PCT和CRP水平均可用于細菌性膿毒癥的診斷和預(yù)后評估，但血清PCT的敏感性和特異性比血清CRP更好。

③ 乳酸：是診斷膿毒癥的有效指標。緊急情況下乳酸水平可為心血管意外和組織低灌注提供早期線索，除了評估血清電解質(zhì)，血氣分析亦有助于危重患者的臨床評估和管理[21]。

(2) 微透析技術(shù)(MD)檢測：微透析技術(shù)可用于測定人體組織間液中的小分子和大分子物質(zhì)。Ditz等[22]發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠組織間質(zhì)中乳酸及甘油水平、肌肉組織中乳酸/丙酮酸比值及乳酸/葡萄糖比值均會明顯增高。Nikitas 等[23]通過微透析技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)即使在血乳酸水平正常(<2 mmol/L)的患者，脂肪組織中乳酸/丙酮酸比值的變化趨勢仍有明顯統(tǒng)計學(xué)意義。死亡患者脂肪組織中乳酸/丙酮酸比值明顯高于幸存者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

(3) 尿液標本檢測：中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)是一種分泌性蛋白。NGAL可作為早期預(yù)測及評價膿毒癥伴有急性腎損傷的一個獨立生物學(xué)標記[24]。研究表明NGAL在正常腎組織中呈低水平表達，但在腎缺血/再灌注損傷和順鉑誘導(dǎo)小鼠腎損傷模型中，損傷后3 h時的尿液中即可檢測到NGAL，明顯早于尿N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(N-Acetyl-β-glucosaminase，NAG)、β2-微球蛋白、及血清肌酐(serum creatinine, SCr)的改變，是目前基礎(chǔ)實驗中經(jīng)常選用的評價急性腎損傷的指標[25]。

四、展望

盡管上述各種膿毒癥模型存在諸多局限，也沒有一種膿毒癥模型能完全再現(xiàn)膿毒癥的演變過程，但是膿毒癥模型對膿毒癥研究領(lǐng)域仍有不可替代的作用。根據(jù)實驗需要，制作不同的符合要求的膿毒癥模型，是研究膿毒癥的必不可少的一種手段。MD技術(shù)已被確立為一種可靠的體內(nèi)工具，具有在體、實時、在線取樣等優(yōu)勢，可精確檢測膿毒癥能量代謝產(chǎn)物乳酸、丙酮酸等。隨著MD技術(shù)在膿毒癥研究中的成熟，有望應(yīng)用MD技術(shù)準確監(jiān)測膿毒癥演變過程，不斷完善膿毒癥動物模型的制備，為膿毒癥疾病的研究，診治提供支持。

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(本文編輯：張大春)

郭松喜，王丹，王英，等. 膿毒癥實驗動物模型的研究進展[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 8(5)： 635-637.

·綜述·

收稿日期：(2015-01-22)

文獻標識碼：中圖法分類號： R563 A

通訊作者：王英，Email：lilywang0701@sina.cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金(81301662)

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.05.025