項(xiàng)力源 田發(fā)明 劉會仁 胡克儉 劉家寅

他汀類藥物是 3- 羥基 -3- 甲基戊二酰輔酶 A ( 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A，HMG-CoA ) 還原酶抑制劑，通過抑制膽固醇合成鏈中的限速酶 HMG-CoA 還原酶，來減少膽固醇的合成[1]。1999 年 Mundy 等[1]首次發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物有激活成骨細(xì)胞、促進(jìn)骨合成代謝的作用。隨后有研究者發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀能在體內(nèi)和體外環(huán)境下通過提升骨形態(tài)發(fā)生蛋白 ( bone morphogenetic protein，BMP ) 2 和堿性磷酸酶 ( alkaline phosphatase，ALP ) 的表達(dá)水平刺激骨形成，還可以刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 ( bone marrow mesenchyme stromal cells，BMSCs ) 向成骨細(xì)胞分化[2-3]。大量的體外研究實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在體外環(huán)境下，他汀類藥物能夠有效的刺激成骨細(xì)胞的增殖與分化；而在動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，肝臟對藥物有消除作用，血液中的藥物濃度只有 5%[4]。因此，探索一種有效的給藥途徑與給藥劑量成為廣泛臨床應(yīng)用的關(guān)鍵問題。

一、他汀類藥物理化性質(zhì)

以往諸多研究表明他汀類藥物能有效降低血液中低密度脂蛋白膽固醇，但由于他汀類藥物的親脂親水性和化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異，會導(dǎo)致藥物作用機(jī)制不盡相同。他汀類藥物可通過胃和小腸部位吸收，主要的第一遍選擇性吸收在肝臟，通過被動擴(kuò)散經(jīng)肝細(xì)胞的細(xì)胞膜主要負(fù)責(zé)親脂性他汀類藥物的肝攝??；而親水性他汀類藥物通過活性載體的介導(dǎo)，經(jīng)肝微粒體酶系代謝，代謝產(chǎn)物從膽汁排泄，很少從腎臟代謝，進(jìn)而引起對于人體不同組織器官的作用效果的差異[5]。辛伐他汀具有較強(qiáng)的親脂性，近些年對于辛伐他汀促進(jìn)成骨作用的報(bào)道增多，大量文獻(xiàn)也表明辛伐他汀通過不同的機(jī)制促進(jìn)骨形成，包括臨床藥物研究、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)[6]。

二、藥理活性

1. 體內(nèi)給藥：即使存在肝臟的首過消除作用，口服給予辛伐他汀促進(jìn)骨形成的報(bào)道并不少見。Ho 等[7]在去卵巢大鼠模型中口服給予辛伐他汀 ( 10～20 mg / kg / day )，發(fā)現(xiàn)辛伐他汀能夠顯著提升股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端和椎骨骨小梁的體積，增加成骨細(xì)胞數(shù)量；免疫組化染色顯示脛骨BMP2、I 型膠原 ( Collagen I，COL I ) 和骨鈣素 ( osteocalcin，OCN ) 蛋白表達(dá)增加，這說明口服辛伐他汀能夠防止去卵巢大鼠的骨量丟失，促進(jìn)骨形成。蔡羽中等[8]在辛伐他汀與BMP2 促進(jìn)兔橈骨骨折愈合的對比觀察中發(fā)現(xiàn)，口服辛伐他汀與骨折處局部注射 BMP2 在促進(jìn)骨痂的形成、改建及骨髓腔的再通率相差不大 (P＞0.05 )，均能促進(jìn)膠原纖維、軟骨組織、骨小梁及骨基質(zhì)的形成。

2. 體外給藥：田發(fā)明等[9]用辛伐他汀刺激體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的大鼠 BMSCs 成骨分化，辛伐他汀 ( 10-7M ) 組 ALP 活性明顯高于對照組，在大鼠 BMSCs 基因表達(dá)譜的 22 575 個(gè)基因中共檢測出 678 個(gè)差異表達(dá)基因，其中包括 ALP1、TGF1 ( transforming growth factor 1 )、OCN ( osteocalcin )、DLX5( distal-less homeobox 5 )、Axin2 ( axis inhibition protein 2 )、BMP2、IBSP ( integrin-binding sialoprotein )、MMP13( matrix metalloproteinases ) 等與成骨分化相關(guān)的基因，證明了辛伐他汀能夠促進(jìn)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的 BMSCs 向成骨細(xì)胞分化，其作用機(jī)制可能與調(diào)控多種成骨相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。Pagkalos 等[10]首次報(bào)道了辛伐他汀在缺少成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的條件下，誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，提高 OCN 和成骨轉(zhuǎn)錄因子 Osx ( osetrix ) mRNA 的表達(dá)，增強(qiáng)礦化作用。Liu 等[11]用不同濃度的辛伐他汀 ( 1～100 nm ) 干預(yù)牙槽骨成骨細(xì)胞 ( alveolar osteoblasts，AOBs )和牙周膜細(xì)胞 ( periodontal ligament cells，PDLs ) 發(fā)現(xiàn)，濃度為 1 nm 和 100 nm 濃度的辛伐他汀能夠分別增加 AOBs 和PDLs 的 ALP 活性，辛伐他汀還可提高這兩種細(xì)胞中 OPG( osteopontin )、和 OCN mRNA 的表達(dá)水平，從而促進(jìn)骨形成。以上實(shí)驗(yàn)說明，在離體培養(yǎng)的多種成骨細(xì)胞前體細(xì)胞中給予辛伐他汀可促進(jìn)成骨細(xì)胞特異性標(biāo)志物表達(dá)水平的增高，起到促進(jìn)成骨分化的作用。

三、作用機(jī)制

在體內(nèi)、外研究中發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物的應(yīng)用均有成骨細(xì)胞特異性標(biāo)志物表達(dá)水平的增高；除此之外，多種細(xì)胞信號通路都參與調(diào)控成骨分化過程。Mundy 等[1]發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可以通過抑制降低破骨細(xì)胞特異性標(biāo)記物抗酒石酸磷酸酶表達(dá)水平降低破骨細(xì)胞活性；Maeda 等[12]報(bào)道辛伐他汀通過誘導(dǎo) BMP2、ALP mRNA 的表達(dá)，促進(jìn)骨基質(zhì)蛋白如 COL I、OCN、骨唾液蛋白 ( bone sialoprotein，BSP )等蛋白水平的上調(diào)，從而增強(qiáng)骨形成；Yamashita 等[13]發(fā)現(xiàn)辛伐他汀通過抑制 TNF-α ( tumor necrosis factor ) -Ras( receptor tyrosine kinase ) / Rho / MAPK ( mitogen-activated protein kinase ) 信號通路和促進(jìn) BMP-Smad ( drosophila mothers against decapentaplegic protein ) 信號通路，誘導(dǎo)BMPs 蛋白的表達(dá)從而刺激成骨分化；Chen 等[14]發(fā)現(xiàn)辛伐他汀能夠提高成骨細(xì)胞活力，并通過 Ras / Smad / Erk /BMP-2 信號通路上調(diào) BMP2、ALP、BSP 和 COL I mRNA表達(dá)，正性調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞代謝，刺激成骨分化；辛伐他汀還能通過 ERK1 / 2、經(jīng)典 Wnt ( wingless-type ) 通路，上調(diào)COL I、OCN、骨橋蛋白 ( osteopontin，OPN ) mRNA 的表達(dá)水平，促進(jìn)胚胎干細(xì)胞、牙周膜細(xì)胞成骨分化[15-16]；Qiao等[16]在胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)過程中加入辛伐他汀，在培養(yǎng)后 7 天 ALP 活性明顯增高，培養(yǎng)后 14 天礦化作用明顯，同時(shí)上調(diào) Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 2 ( runt-related transcription factor 2，Runx2 )、Osx、OCN mRNA 表達(dá)水平，OCN、OPN 和 COL I 蛋白表達(dá)水平；當(dāng)阻斷經(jīng)典 Wnt 信號通路后，以上表現(xiàn)均下調(diào)，更加證明了經(jīng)典 Wnt 信號通路參與了辛伐他汀成骨的作用調(diào)控過程；低劑量的辛伐他汀對成骨的增殖和分化也有促進(jìn)的作用，這可能和其抑制了甲羥戊酸途徑有關(guān)。親脂性他汀類藥物的短暫作用就足以啟動成骨的級聯(lián)反應(yīng)，這可能與 BMP2 的激增有關(guān)[17]。Ghosh-Choudhury 等[18]用洛伐他汀刺激磷脂酰肌醇 3-激酶( phosphatidylinositol 3-Kinase，PI3K ) p58 調(diào)節(jié)亞單位的酪氨酸磷酸化，進(jìn)而提升成骨細(xì)胞內(nèi)激酶的活性；洛伐他汀還能迅速激活 Ras 從而活化質(zhì)膜上的 PI3K，通過調(diào)節(jié) ERK( extracellular-signal-regulated kinases ) 信號通路誘導(dǎo) BMP2的表達(dá)，刺激成骨細(xì)胞分化。辛伐他汀和洛伐他汀都能夠通過 ERK 信號通路促進(jìn)牙周膜細(xì)胞 ALP 活性和增強(qiáng)基質(zhì)礦化，刺激血管內(nèi)皮生長因子，促進(jìn)成骨分化[15,19]。

四、給藥途徑和劑量

由于肝臟代謝作用，辛伐他汀口服給藥不能被很好地吸收，只有不到 5% 的口服劑量進(jìn)入體循環(huán)[20]。藥物在骨髓中的濃度尚不明確，以現(xiàn)有的口服給藥方式，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞在骨髓中接觸的藥物濃度是非常低的[21]。體內(nèi)成功應(yīng)用他汀類藥物的保證是選用合適的緩釋系統(tǒng)和給藥劑量。良好的載體可以為新生骨塑性，抑制骨降解率。因此，選擇能夠避開肝臟首過消除作用的給藥途徑、載體以及合適的給藥劑量，特別是尋找不同給藥途徑下達(dá)穩(wěn)態(tài)血藥濃度的最低給藥劑量，已成為他汀類藥物應(yīng)用于臨床治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵。

研究報(bào)道，將帶有辛伐他汀涂層的鈦植入物植入體內(nèi)，其周圍可觀察到大量新生骨形成[22]。明膠海綿是一種生物相容性、生物吸收性和可塑性非常好的材料。研究發(fā)現(xiàn)，在 Wista 大鼠下頜骨直徑為 3 mm 的骨缺損內(nèi)填充浸有辛伐他汀的明膠海綿后，與對照組 ( 占有水的明膠海綿植入到骨缺損部位的大鼠 ) 相比有 240% 的新生骨形成[23]。Nyan 等[24]對比硫酸鈣與含有 1 mg 辛伐他汀的硫酸鈣對成骨的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，只有后者具有促進(jìn)成骨的能力。下頜骨切牙拔出后，用含有 1 mg 辛伐他汀的聚乳酸 /聚乙醇酸復(fù)合物填充骨缺損，能夠促進(jìn)缺損處骨形成的速率[25]。這些載體的主要目的是定位并保持分子作用的部位、降低給藥劑量并促使藥物向細(xì)胞滲透，以促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化[20]。

王晶瑩等[26]在直徑為 10 mm 的顱骨全層極限缺損模型中，向缺損區(qū)植入含有辛伐他汀 20 mg 的聚乳酸40 mg，術(shù)后 8 周 X 線片顯示，實(shí)驗(yàn)組 ( 缺損區(qū)植入辛伐他汀 20 mg，聚乳酸 40 mg ) 內(nèi)動物大部分骨缺損區(qū)顯示為不規(guī)則的高密度陰影，對照組 ( 缺損區(qū)單純植入聚乳酸40 mg ) 內(nèi)動物大部分缺損區(qū)域仍為低密度透光影；不脫鈣骨組織切片甲苯胺藍(lán)染色顯示，術(shù)后 4 周實(shí)驗(yàn)組骨缺損區(qū)有少量新骨形成，術(shù)后 8 周實(shí)驗(yàn)組骨缺損區(qū)被大量骨組織充填。Mukozawa 等[27]在日本大白兔保留骨膜的直徑為5 mm 的 5 處鼻骨骨缺損上，分別用 2.5 mg / ml 濃度的辛伐他汀水凝膠和端膠原海綿填充骨缺損，發(fā)現(xiàn)兩種載體在給藥后 2 和 4 周 BMP2 蛋白的表達(dá)明顯增高，兩種載體的效果無明顯差異 (P＞0.05 )。靜電紡絲可生物降解纖維是一種納米或微米級高多孔性材料，可模擬自然細(xì)胞基質(zhì)的環(huán)境，多用于骨組織工程學(xué)中作為藥物載體，可使藥物緩慢釋放。Wadagaki 等[28]報(bào)道了靜電紡絲可生物降解纖維緩釋辛伐他汀的效果，發(fā)現(xiàn)給藥后 1 天釋放 5%，給藥后 1～7 天一直保持穩(wěn)定的釋放速度，給藥后 14 天大概釋放 35%，給藥后 28 天釋放55%，且給藥后 14 天辛伐他汀組促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和抑制破骨細(xì)胞分化的作用較對照組( 靜電紡絲可生物降解纖維未加入辛伐他汀 ) 細(xì)胞明顯增加，并能促進(jìn)鈣沉積。Yin 等[29]發(fā)現(xiàn)，大劑量 ( 10% ) 辛伐他汀的大孔鈣磷酸鹽骨水泥會引起降低抗壓強(qiáng)度，誘發(fā)嚴(yán)重的肌肉壞死和炎性反應(yīng)；而小劑量 ( 1% ) 的辛伐他汀大孔鈣磷酸鹽骨水泥對細(xì)胞理化性質(zhì)和生物相容性沒有影響，且能增強(qiáng)孔內(nèi)的成骨潛力。

綜上所述，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均證實(shí)他汀類藥物具有成骨分化潛能，主要通過促進(jìn) BMP2 的表達(dá)，進(jìn)而提高成骨細(xì)胞的特異性標(biāo)記物表達(dá)水平，從而發(fā)揮成骨作用。在此過程中，有多條信號通路參與調(diào)控，包括 MAPKs、Wnts 和BMP-Smad 等。體內(nèi)局部給藥可以在缺損部位短時(shí)間達(dá)到藥物作用濃度，降低用藥劑量，降低血藥濃度，以減少不良反應(yīng)。

[1] Mundy G, Garrett R, Harris S, et al. Stimulation of bone formation and in rodents by statins. Science, 1999, 286 (5446):1946-1949.

[2] Montagnani A, Gonnelli S, Cepollaro C, et al. Effect of simvastatin treatment on bone mineral density and bone turnover in hypercholesterolemic postmenopausal women: a 1-year longitudinal study. Bone, 2003, 32(4):427-433.

[3] Wang JW, Xu SW, Yang DS, et al. Locally applied simvastatin promotes fracture healing in ovariectomized rat. Osteoporos,2007, 18(12):1641-1650.

[4] Desager JP, Horsmans Y. Clinical pharmacokinetics of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors.Clin Pharmacokinet, 1996, 31(5):348-371.

[5] Schachter M. Chemical, pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of statins: an update. Fundam Clin Pharmacol, 2005, 19(1):117-125.

[6] Wong RW1, Rabie AB. Statin-induced osteogenesis uses in orthodontics: a scientific review. World J Orthod, 2006,7(1):35-40.

[7] Ho ML, Chen YH, Liao HJ, et al. Simvastatin increases osteoblasts and osteogenic proteins in ovariectomized rats. Eur J Clin Invest, 2009, 39(4):296-303.

[8] 蔡羽中, 何愛詠, 王欣文, 等. 辛伐他汀與BMP2促進(jìn)兔橈骨骨折愈合的對比觀察研究. 生物醫(yī)學(xué)工程與臨床, 2011,15(1):10-14.

[9] 田發(fā)明, 張柳, 孟亞強(qiáng), 等. 辛伐他汀促進(jìn)大鼠BMSCs分化為成骨細(xì)胞. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2010, 30(8):820-825.

[10] Pagkalos J, Cha JM, Kang Y, et al. Simvastatin induces osteogenic differentiation of murine embryonic stem cells.J Bone Miner Res, 2010, 25(11):2470-2478.

[11] Liu S, Bertl K, Sun H, et al. Effect of simvastatin on the osteogenetic behavior of alveolar osteoblasts and periodontal ligament cells. Hum Cell, 2012, 25(2):29-35.

[12] Maeda T, Matsunuma A, Kawane T, et al. Simvastatin promotes osteoblast differentiation and mineralization in MC3T3-E1 cells. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 280(3):874-877.

[13] Yamashita M, Otsuka F, Mukai T, et al. Simvastatin antagonizes tumor necrosis factor-alpha inhibition of bone morphogenetic proteins-2-induced osteoblast differentiation by regulating Smad signaling and Ras/Rho-mitogen-activated protein kinase pathway. J Endocrinol, 2008, 196(3):601-613.

[14] Chen PY, Sun JS, Tsuang YH, et al. Simvastatin promotes osteoblast viability and differentiation via Ras/Smad/Erk/BMP-2 signaling pathway. Nutr Res, 2010, 30(3):191-199.

[15] Kim IS, Jeong BC, Kim OS, et al. Lactone form 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors (statins)stimulate the osteoblastic differentiation of mouse periodontal ligament cells via the ERK pathway. J Periodontal Res, 2011,46(2):204-213.

[16] Qiao LJ, Kang KL, Heo JS. Simvastatin promotes osteogenic differentiation of mouse embryonic stem cells via canonical Wnt/β-catenin signaling. Mol Cells, 2011, 32(5):437-444.

[17] Yazawa H, Zimmermann B, Asami Y, et al. Simvastatin promotes cell metabolism, proliferation, and osteoblastic differentiation in human periodontal ligament cells.J Periodontol, 2005, 76(2):295-302.

[18] Ghosh-Choudhury N, Mandal CC, Choudhury GG. Statininduced ras activation integrates the phosphatidylinositol 3-kinase signal to akt and MAPK for bone morphogenetic protein-2 expression in osteoblast differentiation. J Biol Chem,2007, 282(7):4983-4993.

[19] Takenaka M, Hirade K, Tanabe K, et al. Simvastatin stimulates VEGF release via p44/p42 MAP kinase in vascular smooth muscle cells. Biochem Biophys Res Commun, 2003, 301(1):198-203.

[20] Park JB. The use of simvastatin in bone regeneration. Med Oral Patol Oral Cir Bucal, 2009, 14(9):e485-488.

[21] Gutierrez GE, Lalka D, Garrett IR, et al. Transdermal application of lovastatin to rats causes profound increases in bone formation and plasma concentrations. Osteoporos Int,2006, 17(7):1033-1042.

[22] Yoshinari M, Hayakawa T, Matsuzaka K, et al. Oxygen plasma surface modification enhances immobilization of simvastatin acid. Biomed Res, 2006, 27(1):29-36.

[23] Oze? I, Kili? E, Gümü? C, et al. Effect of local simvastatin application on mandibular defects. J Craniofac Surg, 2007,18(3):546-550.

[24] Nyan M, Sato D, Oda M, et al. Bone formation with the combination of simvastatin and calcium sulfate in critical-sized rat calvarial defect. J Pharmacol Sci, 2007, 104(4):384-386.

[25] Wu Z, Liu C, Zang G, et al. The effect of simvastatin on remodelling of the alveolar bone following tooth extraction. Int J Oral Maxillofac Surg, 2008, 37(2):170-176.

[26] 王晶瑩, 宋泉生, 朱靜琳, 等. 辛伐他汀復(fù)合聚乳酸修復(fù)顱骨極限缺損的實(shí)驗(yàn)研究. 中國微創(chuàng)外科雜志, 2009, 9(12):1148-1151.

[27] Mukozawa A, Ueki K, Marukawa K, et al. Bone healing of criticalsized nasal defects in rabbits by statins in two different carriers. Clin Oral Implants Res, 2011, 22(11):1327-1335.

[28] Wadagaki R, Mizuno D, Yamawaki-Ogata A, et al. Osteogenic induction of bone marrow-derived stromal cells on simvastatinreleasing, biodegradable, nano- to microscale fiber scaffolds.Ann Biomed Eng, 2011, 39(7):1872-1881.

[29] Yin H, Li YG, Si M, et al. Simvastatin-loaded macroporous calcium phosphate cement: Preparation, in vitro characterization, and evaluation of in vivo performance. J Biomed Mater Res A, 2012, 100(11):2991-3000.