肖鋒綜述，譚軍審校

（1.湖南師范大學第一附屬醫(yī)院整形激光美容外科湖南長沙410000；2.湖南省人民醫(yī)院整形激光美容外科湖南長沙410000）

毛囊干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定

肖鋒1綜述，譚軍2審校

（1.湖南師范大學第一附屬醫(yī)院整形激光美容外科湖南長沙410000；2.湖南省人民醫(yī)院整形激光美容外科湖南長沙410000）

毛囊干細胞是皮膚組織工程理想的種子細胞，已成為近年來的研究熱點之一。分離培養(yǎng)及鑒定是其研究的基礎(chǔ)手段，作者將近年來毛囊干細胞幾種常用的分離培養(yǎng)及鑒定方法進行較為系統(tǒng)的分析、總結(jié)和歸納，為毛囊干細胞的深入研究提供堅實的基礎(chǔ)。

毛囊干細胞；鑒定；分離培養(yǎng)

干細胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細胞，存在于胚胎及成體內(nèi)。在一定條件下，干細胞可以無限增殖而保持未分化狀態(tài)，也可以分化成多種功能細胞。20世紀，Cotsarel is、Taylor等［1］通過相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在毛囊上部由外根鞘形成的明顯突起，即隆突區(qū)域也有干細胞的存在，這些干細胞被定義為毛囊干細胞。毛囊干細胞與其他成體干細胞一樣擁有強大的增殖能力及多向分化潛能［2］。毛囊干細胞能通過自身的分裂增殖產(chǎn)生各種機體所需的細胞，以補充脫落和缺失的細胞；毛囊干細胞不僅能夠向下轉(zhuǎn)移到毛囊根部生成毛囊，而且還能從毛囊外根鞘向上遷移，生成表皮和皮脂腺，并且能分化形成骨及脂肪［3-4］。近年來，毛囊干細胞的研究備受關(guān)注，已成為研究熱點之一。目前，存在多種毛囊干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定方法，為毛囊干細胞的深入研究提供了堅實的基礎(chǔ)，作者就毛囊干細胞常用的分離培養(yǎng)及鑒定作一簡要綜述。

1　毛囊干細胞的分離純化

此前，已有許多研究者采用不同的方法來分離毛囊干細胞，并成功地進行傳代培養(yǎng)，進行后續(xù)更深入的研究。目前對毛囊干細胞分離純化常用的有以下幾種方法：

1.1組織塊培養(yǎng)法

取含有毛囊的皮膚樣本，清潔干凈，酒精消毒后用PBS液沖洗，將皮膚切成小塊，表皮朝上貼于加入適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿中，置于5%CO2培養(yǎng)箱中，37℃，飽和濕度條件下培養(yǎng)。組織塊培養(yǎng)法分離的干細胞能持續(xù)保持增殖趨勢，沒有明顯的平臺期，并且隨著不斷傳代純化，此方法獲得的毛囊干細胞純度明顯增加。但是組織塊培養(yǎng)法分離獲取毛囊干細胞的效率較低。史明艷等［5］使用該方法成功獲得毛囊干細胞，并分析指出該方法的優(yōu)勢在于組織塊培養(yǎng)時從組織塊中遷移出來其他細胞為毛囊干細胞創(chuàng)造了一個類似于體內(nèi)的微環(huán)境，使毛囊干細胞能最大程度地保留增殖分化能力。

1.2顯微分離技術(shù)

取含有毛囊的皮膚樣本，清潔干凈，除去皮下脂肪，酒精消毒后，使用含高濃度青、鏈霉素的PBS液反復(fù)沖洗3次；在超凈工作臺內(nèi)，顯微鏡下顯微鑷鈍性分離單個毛囊組織，收集形態(tài)完好且處于生長期的毛囊。收集濾液離心（1 500r/min）10min，棄去上清，加入含培養(yǎng)基培養(yǎng)皿，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。顯微分離技術(shù)能從樣本直接選取毛囊干細胞相對富集區(qū)域，有利于后續(xù)進一步的純化［6］。王祝遷等［7］使用此方法成功分離出大鼠毛囊干細胞，但單純應(yīng)用顯微分離技術(shù)獲取高純度的毛囊干細胞需花費大量的時間和精力，效率偏低。

1.3酶消化法

取含有待培養(yǎng)毛囊的皮膚樣本，清潔干凈，酒精消毒后用含雙抗PBS液沖洗，將皮膚樣本剪成小塊，置于中性蛋白酶Ⅱ（0.25g/l）中，37℃搖床消化2h。取出組織用PBS沖洗3遍，置于胰蛋白酶（質(zhì)量濃度為2.5g/l）和乙二胺四乙酸（0.2g/l）1∶1消化液37℃搖床消化1h后，過200目鋼網(wǎng)。收集濾液離心（1 500r/min）10min，棄去上清，加入細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。此方法獲得的毛囊干細胞克隆形成能力強，獲取效率高。鄭宣等［8］用此法獲得較純的毛囊干細胞，但獲得的毛囊干細胞經(jīng)歷增殖期后生長速度逐漸減慢，且細胞存活率下降，可能與酶消化法破壞了毛囊干細胞生長微環(huán)境有關(guān)。

1.4差數(shù)貼壁法

將收集的細胞接種于Ⅳ型膠原包被的培養(yǎng)皿中，靜置20min后，收集上層未貼附角質(zhì)形成細胞和毛囊真皮成纖維細胞于另一培養(yǎng)皿中，貼附皿底的毛囊干細胞，置于體積分數(shù)為5%CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)，每3d換液一次。與單純使用某種毛囊干細胞分離方法相比較，聯(lián)合差數(shù)貼壁法將更進一步純化，獲得純度更高的毛囊干細胞。彭彧等［9］使用酶消化法聯(lián)合差數(shù)貼壁法獲得了形態(tài)典型且均勻一致的毛囊干細胞。目前此方法已被廣泛使用。

1.5免疫磁珠法

免疫磁珠法主要用來純化分離培養(yǎng)獲得的毛囊隆突區(qū)細胞中某種標記物陽性的細胞。首先制作細胞懸液，并加入FITC標記的某種標記物單抗，室溫孵育30min，離心后棄上清中未結(jié)合的抗體，加入磁珠分選緩沖液重懸細胞，再次離心后棄上清，PBS緩沖液清洗2次，取重懸后細胞與免疫磁珠混合，室溫反應(yīng)30min。磁珠分離器分離8min，去除未與磁珠結(jié)合的細胞。將結(jié)合了靶細胞的免疫磁珠用磁珠分選緩沖液洗5次。體積分數(shù)為5%CO2、37℃孵箱培養(yǎng)48h，使細胞與磁珠分離，即可獲得較純的毛囊干細胞。譚挺等［10］用此法獲得高純度毛囊干細胞，他們指出此方法與顯微分離技術(shù)連用有單次操作分離細胞數(shù)量大且純度較高、能與細胞培養(yǎng)、流式細胞術(shù)、熒光顯微鏡等分子生物學技術(shù)兼容等特點。黃恩毅等［11］用此法有效分離并成功培養(yǎng)CD34+毛囊干細胞，發(fā)現(xiàn)分選后的細胞仍具有較好的活性，且增殖速度快，增殖期長。盧葳等［6］通過實驗證實，免疫磁珠分選后毛囊干細胞活力較好，分離獲得的毛囊干細胞適合用于細胞培養(yǎng)、誘導等后續(xù)試驗。

1.6流式細胞儀分選法

通過毛囊干細胞表達的某些特異性標記物，利用流式細胞儀可以將目的活細胞從異質(zhì)性細胞群中分離出來，獲得較高純度的特異性細胞。常用的是熒光激活細胞分選器。盧葳等［6］使用流式細胞儀分選CD34+毛囊干細胞，獲得的毛囊干細胞純度很高、污染機會小，但是分選過程費時，細胞分選后活力稍差。此方法適合于需要做免疫組化，蛋白質(zhì)組織學等對細胞純度要求高的實驗。

2　毛囊干細胞的鑒定

干細胞的鑒定一直是干細胞研究的難點，常用干細胞的標記物輔助方法進行鑒定。毛囊干細胞有多種明確的分子標記物，如CD34、K15、K19［12］。

2.1角蛋白家族

角蛋白是外胚層細胞的結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛存在于生物體的組織結(jié)構(gòu)中。在表皮細胞中，它們以微絲的狀態(tài)在細胞內(nèi)形成廣泛的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在上皮組織中有20多種不同種類的角蛋白表達。在表皮細胞中，隨著分化程度的不同其所表達的角蛋白也不相同，因此角蛋白常作為毛囊干細胞的鑒定手段。1998年，lyle等［13］通過表達克隆發(fā)現(xiàn)K15是毛囊干細胞表面標記之一，此后K15一直被當做較為公認的毛囊干細胞標記物。20世紀末，有研究者通過實驗發(fā)現(xiàn)滯留細胞所在的毛囊隆突部細強表達K19［14］；同時有實驗發(fā)現(xiàn)毛囊隆突部K19高表達細胞缺乏特異性分化標志，進一步證實K19高表達細胞為毛囊干細胞，因此，認為K19也可作為毛囊干細胞表面標記物［15］。在毛囊干細胞分化過程中，K15表達減弱較K19早，K19表達陽性而K15陰性的細胞仍有可能為處于早期階段的增殖細胞，因此推測，檢測毛囊干細胞時K15更準確［13］。

2.2鈣黏蛋白家族

鈣黏蛋白是一種同親型結(jié)合、Ca2+依賴的細胞黏著糖蛋白，對胚胎發(fā)育中的細胞識別、遷移和組織分化以及成體組織器官構(gòu)成具有重要作用。不同細胞及發(fā)育不同階段其細胞表面的鈣黏蛋白的種類與數(shù)量均有所不同，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幾十種鈣黏蛋白。CD34抗原是鈣黏蛋白中的一種，是一種高度糖基化Ⅰ型跨膜蛋白，為階段特異性白細胞分化抗原，CD34表達于人類造血干細胞，CD34是目前公認的造血干細胞標志物。Ohyama等［16］通過對鼠毛囊的研究，發(fā)現(xiàn)鼠毛囊中CD34陽性細胞與毛囊隆突部滯留細胞和K15陽性細胞在毛囊處位置一致，提示CD34可能也是可靠的毛囊干細胞標記物。Trempus等［17］通過動物實驗首次證實了CD34表達于小鼠毛囊干細胞。但CD34在人毛囊干細胞不表達，Shu Jiang等［18］通過對人頭皮進行原位免疫組化和多色免疫熒光標記，發(fā)現(xiàn)CD34特異性表達于毛囊間表皮基底部。

2.3整合素家族

整合素是機體重要的黏附分子，是廣泛存在于動植物細胞表面的一類細胞跨膜蛋白，在細胞與細胞外基質(zhì)間及細胞與細胞間起黏附作用，整合素是由α和β兩個亞單位組成的異源二聚體，它們按不同的組合構(gòu)成20余種整合素。目前，整合素也被廣泛用于毛囊干細胞的鑒定，常用的整合素為整合素β1。1995年，Jones等［19］根據(jù)表皮細胞表達整合素β1的水平將其進行分組培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)整合素β1高表達的表皮細胞比低表達者具有更高的增殖及克隆形成能力。1998年，Wat t等［20］發(fā)現(xiàn)，富含整合素β1的皮膚基底細胞比整合素β1含量少的皮膚基底細胞能更快速的黏附細胞外基質(zhì)蛋白，并具有更高的克隆形成能力，上述發(fā)現(xiàn)均為整合素β1作為毛囊干細胞特異性表面標記物提供有力支持。

3　結(jié)論

綜上，目前常用的分離培養(yǎng)方法主要包括：組織塊培養(yǎng)法、顯微分離技術(shù)、酶消化法、差數(shù)貼壁法、免疫磁珠法、流式細胞儀分選法，每種方法均有各自的優(yōu)勢及缺陷；組織塊培養(yǎng)法簡單，但是分離純度不高，分離效率低下；顯微分離技術(shù)相對其他方法而言，分離純度高，但是分離過程比較費時費力；酶消化法效率高，但是酶消化過程同時會破壞細胞微環(huán)境，影響細胞存活率；差數(shù)貼壁法一般聯(lián)合其他分離純化方法，能進一步純化所獲毛囊干細胞；免疫磁珠法獲得的毛囊干細胞純度高、活性強，但是分離方法較復(fù)雜；流式細胞儀分選法所獲得毛囊干細胞純度高，但細胞活性低。因此，在選擇毛囊干細胞分離培養(yǎng)方法時一定要根據(jù)實驗的特殊要求及實驗條件選擇合適的方法。毛囊干細胞的鑒定方法常用的包括：角蛋白家族、鈣黏蛋白家族、整合素家族；實驗條件允許的情況下，同時檢測兩種以上的標記物來鑒定毛囊干細胞是較為準確的一種方法。

毛囊干細胞具有其他干細胞的共同特征，具有多向分化潛能。目前，已有實驗證實毛囊干細胞能用于尿道缺損、神經(jīng)損傷的修復(fù)；能夠分化成為脂肪細胞和成骨細胞［1，21-22］；能有效促進創(chuàng)面愈合，將其作為工程皮膚中的種子細胞，有利于表皮細胞及汗腺、毛囊等附屬器官的形成。另外，最新研究表明毛囊干細胞有利于瘢痕的修復(fù)，但該研究仍處于起步階段，相信經(jīng)過研究者們的不懈努力，其必將為瘢痕治療這一世界性難題提供一種有效的新方法。

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編輯/李陽利

The cultivation and identification of hair follicle stem cells

XIAO Feng1，TAN Jun2
（Departmentof Plastic and Laser Aesthetic Surgery，Peop le's Hosp italofHunan Province，Changsha 410000，Hunan，China）

Hair follic le stem cells are the ideal seed cells for skin tissue eng ineering，which has become a hot research top ic in recent years.Isolation and identification is the basis of the research. The author w ill analyze and summarize severalmethods o f isolation and culture o f hair follic le stem cells in recentyears.Itwillp rovide a solid foundation for the further study ofhair follic le stem ce lls.

hair follic le stem cells；identification；cultivation

R329.2

A

1008-6455（2015）19-0077-04

2015-07-07

2015-08-30