郝愛平

摘要：利用CEL I核酸內(nèi)切酶能切割掉異源雙鏈DNA分子中錯(cuò)配的單核苷酸堿基對的特性，研究了CEL I核酸內(nèi)切酶是否能提高基因合成的正確率。結(jié)果表明，CEL I核酸內(nèi)切酶不僅能切割掉雙鏈DNA分子中錯(cuò)配的單核苷酸堿基對，同時(shí)也能引入外源堿基對，使合成的目的雙鏈DNA分子中錯(cuò)誤率增加，不能達(dá)到提高基因合成正確率的目的。

關(guān)鍵詞：CEL I酶；雙鏈DNA分子；基因合成正確率

中圖分類號：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）22-5562-03

CELI酶是Oleykowski等[1]在1998年發(fā)現(xiàn)的一種單鏈特異性核酸酶（Single-strand specific nuclease），該酶能較好地識別異源雙鏈DNA分子中錯(cuò)配的堿基對，屬于胞內(nèi)酶的一種[2]，其等電點(diǎn)為6.0～6.5，分子質(zhì)量為43 ku，催化活性需Mg2+和Zn2+的共同參與完成[3]。這類酶如S1核酸酶和綠豆核酸酶在20多年前就已廣泛應(yīng)用于切割雙鏈DNA分子中的末端單鏈懸突，這兩種酶具有相同的關(guān)鍵殘基和類似的結(jié)構(gòu)，但是在切割單核苷酸堿基對時(shí)表現(xiàn)出較大的差異[4，5]。早期研究表明，這類酶可以切割雙鏈DNA分子中的錯(cuò)配位點(diǎn)，但是之后的研究表明這種切割是不可行的[2，6-8]。

CEL I酶是目前生物界發(fā)現(xiàn)的惟一能準(zhǔn)確切割異源雙鏈DNA中存在錯(cuò)配位點(diǎn)的酶[9]。CEL I酶在切割雙鏈DNA時(shí)除了會切割掉錯(cuò)配的堿基對以外，究竟會不會對雙鏈DNA產(chǎn)生其他影響尚不得而知，能否將此酶應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)中優(yōu)化PCR環(huán)節(jié)，目前尚無確切相關(guān)的試驗(yàn)證據(jù)。因此，本研究通過探討CEL I酶對基因合成正確率的影響，以達(dá)到減少基因合成錯(cuò)誤率、降低生產(chǎn)成本、優(yōu)化整個(gè)生產(chǎn)流程的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用基因引物及試劑由金唯智（蘇州）生物科技有限公司提供；CEL I酶試劑盒購自美國環(huán)球基因有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GC百分含量、片段大小，利用PRIMER軟件分析發(fā)卡結(jié)構(gòu)和破壞發(fā)卡結(jié)構(gòu)所需的能量，設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)氖孜惨?，每條基因引物長度在30 bp左右。將基因引物限制在每組2～16條之間。本試驗(yàn)分為4組，每組基因全長都在800～900 bp之間（試驗(yàn)最終得到的測序結(jié)果所需的測序軟件可信程度在800 bp左右）。

1.2.2 拼接中間片段 第一輪PCR反應(yīng)體系設(shè)為：dNTPs（10 mmol/L）1 μL，5×Tap Buffer 10 μL，pfu DNA聚合酶0.5 μL，基因引物混合物10 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min； 95 ℃變性30 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，20個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。

1.2.3 拼接全長基因 以拼接好的中間片段作為模板，第二輪PCR反應(yīng)體系為：dNTPs （10 mmol/L）1μL，5×Tap Buffer 10 μL，pfu DNA聚合酶 0.5μL，中間片段模板2 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃變性30 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，得到全長基因產(chǎn)物。

1.2.4 CEL I酶切全長基因 利用CEL I酶對全長基因進(jìn)行酶切，酶切體系為：全長基因18 μL，MgCl2（0.15 mmol/L）1.8 μL，Enhancer 1 μL， CEL I酶1 μL， 42 ℃保溫1 h之后，再加入Stop solution 2.2 μL。

1.2.5 拼接經(jīng)CEL I酶剪切后的全長基因 將未經(jīng)CEL I酶剪切修復(fù)的全長基因和經(jīng)CEL I酶剪切已修復(fù)后的全長基因各取2 μL進(jìn)行電泳檢測。如果檢測發(fā)現(xiàn)CEL I酶切前后產(chǎn)物都已擴(kuò)增出，則進(jìn)行下一步試驗(yàn)，如發(fā)現(xiàn)未擴(kuò)增出，則需重新擴(kuò)增。再取2 μL已檢測到的CEL I酶切修復(fù)后產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系和條件都與拼接全長基因時(shí)相同，得到最終CEL I酶切修復(fù)后的全長基因產(chǎn)物。

1.2.6 測序分析 將得到的CEL I酶切后的全長基因產(chǎn)物經(jīng)連轉(zhuǎn)、菌檢后進(jìn)行測序，測序結(jié)果采用Seqman軟件進(jìn)行分析對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 電泳檢測結(jié)果分析

電泳檢測第一組CEL I酶切基因前與酶切后結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，經(jīng)CEL I酶剪切修復(fù)前的全長基因電泳圖比經(jīng)CEL I酶剪切修復(fù)后的全長基因電泳圖亮度強(qiáng)，并且剪切修復(fù)前基因大于剪切修復(fù)后基因長度，造成這種情況可能是CEL I酶剪掉了全長基因中錯(cuò)配的堿基對。

2.2 測序結(jié)果分析

將測序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列用Seqman軟件進(jìn)行比對分析，結(jié)果見表1。經(jīng)過CEL I酶修復(fù)的10條全長基因中有4條（T61070、T60782、T60854、T60856）是完全正確的，另外6條分別有不同情況的缺失和突變。在T61071基因序列中487-522位點(diǎn)全部缺失，可能是CEL I酶將這部分剪掉了；而在基因序列T61072中469-486位點(diǎn)正確的序列被替換成錯(cuò)誤的序列，553位點(diǎn)插入外源錯(cuò)誤序列，這可能是CEL I酶把原來錯(cuò)配的堿基剪掉，又引入了外源錯(cuò)誤序列。

結(jié)果表明，CEL I核酸內(nèi)切酶不僅能切割掉雙鏈DNA分子中錯(cuò)配的單核苷酸堿基對，同時(shí)也能引入外源錯(cuò)誤堿基對。

3 小結(jié)與討論

CELI酶被廣泛應(yīng)用于探討基因多態(tài)性和基因功能的關(guān)系、人類疾病的個(gè)性化診斷、分子標(biāo)記輔助育種等研究。而運(yùn)用CEL I酶結(jié)合L-ICORDNA序列分析儀（L-ICOR，USA）或ABI遺傳分析儀（Applied biosystem，USA）開發(fā)出的Tilling和Ecotilling技術(shù)，可以發(fā)現(xiàn)大量基因組序列中存在的點(diǎn)突變，許多科學(xué)家已將這種技術(shù)作為研究反向遺傳學(xué)中探討基因功能問題的常用方法之一，并在多種不同動(dòng)植物突變?nèi)后w和自然群體多態(tài)性的研究工作中取得了較好的成績[10-13]。CEL I酶是Tilling和Ecotilling技術(shù)的關(guān)鍵酶，許多研究只是證實(shí)該酶具有在堿基錯(cuò)配處切割異源雙鏈的活性，并未探討該酶對雙鏈DNA以及基因合成的影響[14，15]。endprint

本研究證實(shí)CEL I酶可能會剪掉全長基因中錯(cuò)配的堿基對，也可能剪掉正確的堿基對，還可能在剪掉錯(cuò)配堿基對的同時(shí)引入了外源堿基對，所以不能用CEL I酶來提高生產(chǎn)中PCR程序擴(kuò)增全長基因的正確率。

參考文獻(xiàn)：

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[14] 廖鳳賢，黎佳佳，余舜武.CELI酶的高效檢測及其在Eco-TILLING中的高效應(yīng)用[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，16（1）：1-4.

[15] 田 暢， 王 楓，蔣 倩，等.芹菜核酸內(nèi)切酶CELI基因的克隆及其表達(dá)分析[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，37（4）：39-45.

（責(zé)任編輯 屠 晶）endprint

本研究證實(shí)CEL I酶可能會剪掉全長基因中錯(cuò)配的堿基對，也可能剪掉正確的堿基對，還可能在剪掉錯(cuò)配堿基對的同時(shí)引入了外源堿基對，所以不能用CEL I酶來提高生產(chǎn)中PCR程序擴(kuò)增全長基因的正確率。

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（責(zé)任編輯 屠 晶）endprint

本研究證實(shí)CEL I酶可能會剪掉全長基因中錯(cuò)配的堿基對，也可能剪掉正確的堿基對，還可能在剪掉錯(cuò)配堿基對的同時(shí)引入了外源堿基對，所以不能用CEL I酶來提高生產(chǎn)中PCR程序擴(kuò)增全長基因的正確率。

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