貢東軍　蘇耀輝　邸敬會　等

摘要：研究了地理標(biāo)志產(chǎn)品撫順哈什螞油的HPLC特征圖譜，并對其建立了近紅外光譜鑒別模型，確定了穩(wěn)定、可靠的地理標(biāo)志產(chǎn)品撫順哈什螞油的鑒別方法。

關(guān)鍵詞：撫順哈什螞油；高效液相色譜法；近紅外光譜

中圖分類號：TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）22-5548-04

林蛙油又名哈什螞油、田雞油、蛤蟆油，為蛙科動物林蛙（Rana temporaria）雌性成體的輸卵管干燥后形成的脂肪狀物質(zhì)。林蛙油能夠增加機(jī)體的免疫能力，具有健脾胃、滋陰補(bǔ)腎、潤肺生津之功效，對體虛氣虛、神經(jīng)性頭痛、神經(jīng)衰弱均有效，且有鎮(zhèn)咳平喘的作用[1-4]。目前，學(xué)者對林蛙油的研究主要集中在對其成分的檢測方面[5-11]。本研究選用不同產(chǎn)地的18種林蛙油，建立了撫順哈什螞油近紅外光譜模型，實(shí)現(xiàn)地理標(biāo)志產(chǎn)品撫順哈什螞油的快速、準(zhǔn)確、無損的真?zhèn)舞b別。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 本研究所用樣品見表1。

1.1.2 儀器 美國Agilent 1100型高效液相色譜儀（配備G1310A單元泵、G1312A二元泵、G1311A四元泵、G1313A標(biāo)準(zhǔn)型自動進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1315A/B DAD檢測器），Agilent Instrument色譜工作站；NEX UP 1000型超純水凈化系統(tǒng)；金葉RE52CS-2型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（配備津騰GM-0.33Ⅱ隔膜真空泵）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（配備金葉B-260恒溫水浴鍋）；AR1140型電子天平；德國布魯克光學(xué)儀器公司（Bruker Optics Inc.）MPA傅里葉變換近紅外光譜儀，OPUS 6.5光譜采集及分析軟件。

1.1.3 試劑 甲醇、乙腈均為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.2 色譜條件

色譜柱：Universil C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（最優(yōu)梯度）；檢測波長：276 nm；流速：0.5 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL[8]。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備 精確稱取經(jīng)24 h真空干燥的林蛙油干燥粉末1.000 g，用濾紙包好，放入索氏提取器中。加入適量丙酮，用恒溫水浴鍋加熱6 h，保持溫度為70 ℃。提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸干，色譜純甲醇溶解并定容至10 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過，作為供試品備用，制備了18個來自不同地域的樣品的供試品溶液。

1.3.2 試驗(yàn)方法 通過對不同地域蛙油的處理，提取蛙油中的有機(jī)部分，以乙腈-水為流動相。本試驗(yàn)同時測定300、280和276 nm 3種波長。峰總面積、峰總高度以及峰總數(shù)在檢測波長276 nm處均達(dá)到了最大值。因此，本試驗(yàn)選擇276 nm作為林蛙油的HPLC圖譜檢測波長，進(jìn)而研究和確定撫順哈什螞油的特征峰。以“1.2”的色譜條件進(jìn)行分析測定，得到18個樣品的指紋圖譜。計(jì)算樣品中各色譜峰相對保留時間，并記錄各吸收峰的積分面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC圖譜結(jié)果

通過不同地域蛙油與撫順哈什螞油高效液相色譜圖的比對，發(fā)現(xiàn)蛙油共有的較大的吸收峰出現(xiàn)在相對保留時間為0.491、0.523、0.694、0.834、0.904、1.000 min等處（表2、表3）。撫順哈什螞油在相對保留時間0.491 min處峰面積偏低，且分布不均勻，范圍在10.6～459.0 mAU·min之間；在相對保留時間0.523 min處，撫順哈什螞油吸收峰積分面積平均為320.96 mAU·min，水平居中，分布均勻，此處最高值為吉林延邊蛙油，而黑龍江長白山特級林蛙油此處無吸收峰，可能由于在處理過程中造成一定的損失；在保留時間0.694 min處，各地與蛙油相差不大，內(nèi)蒙蛙油此處吸收峰面積較?。磺逶峡谇版?zhèn)蛙油樣品在相對保留時間0.834 min處有一最大吸收峰，但撫順其他蛙油樣此處吸收峰面積均偏低；在相對保留時間0.904 min處，最大吸收峰仍是來自南口前鎮(zhèn)的樣品，撫順哈什螞油總體水平偏低，吉林蛙油此處吸收峰面積總體水平較高，平均為766.07 mAU·min。在標(biāo)準(zhǔn)吸收峰處，撫順哈什螞油吸收峰總體水平最低，最小吸收峰面積與最高值相差20多倍。北朝蛙油上述幾處吸收峰面積普遍較大。

撫順哈什螞油在相對保留時間為0.870和2.828 min處80%的樣品沒有吸收峰，而其他地域樣品絕大多數(shù)在此處有吸收峰；在相對保留時間0.349 min處吉林蛙油沒有吸收峰，相對保留時間0.349、2.771、3.010 min處撫順哈什螞油大多有吸收峰，而其他地域蛙油在此處大多沒有吸收峰。

2.2 不同地域蛙油近紅外光譜分析研究

通過使用近紅外掃描儀對不同地域林蛙油進(jìn)行掃描，建立了近紅外光譜鑒別模型來實(shí)現(xiàn)對撫順哈什螞油特征因子的鑒別。不同地域蛙油近紅外光譜圖如圖1所示。由圖1可知，撫順哈什螞油與其他地域蛙油的近紅外光譜總體形狀相差不大，因此不能從光譜圖上直接分析不同產(chǎn)地蛙油的差別，借助化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件來對其進(jìn)行處理，采用OPUS化學(xué)計(jì)量學(xué)分析軟件對光譜圖進(jìn)行處理。通過對光譜全波段進(jìn)行研究和分析，發(fā)現(xiàn)在7 321～6 574 cm-1、6 105～5 636 cm-1和5 452～4 148 cm-1 3個波段范圍信息量較豐富，因此選取此光譜區(qū)域進(jìn)行后續(xù)處理。

2.2.1 合格性測試 以撫順哈什螞油近紅外譜作為參考光譜，其他產(chǎn)地蛙油近紅外光譜作為測試光譜，預(yù)處理選擇一階導(dǎo)數(shù)法，光譜波段選擇7 321～6 574 cm-1、6 105～5 636 cm-1和5 452～4 148 cm-1，平滑點(diǎn)數(shù)17，可得參考光譜和測試光譜的最大合格性索引如圖2所示。圖2顯示參考光譜的索引值穩(wěn)定分布在1.2～2.6之間，表明撫順哈什螞油質(zhì)量較穩(wěn)定，而測試光譜的索引值分布在2.7～7.7之間，樣品之間的值較分散且波動較大。合格性測試報告顯示在特定條件下此模型可以將撫順哈什螞油和其他產(chǎn)地蛙油分開，準(zhǔn)確率為100%。endprint

2.2.2 主成分分析 主成分分析是將原變量進(jìn)行變換，用數(shù)目較少的新變量代替原變量，且新變量能最大限度地表征原變量的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)特征，同時去除無用信息。將撫順哈什螞油和其他產(chǎn)地蛙油近紅外譜圖采用減直線法，因子數(shù)為5，光譜范圍為：7 321～6 574 cm-1、6 105～5 636 cm-1和5 452～4 148 cm-1，進(jìn)行主成分分析，并以第一主成分PC1為X軸，第二主成分PC2為Y軸，作主成分（PCA）得分圖如圖3所示。由圖3中可看出，撫順哈什螞油的樣品在主成分特征空間上的分布較為集中，撫順哈什螞油為聚集在圖中標(biāo)識的橢圓型區(qū)域內(nèi)淺色方塊，而其余深色三角為其他產(chǎn)地蛙油樣品，在主成分特征空間上的分布大部分在真品區(qū)之外，表明其與真品質(zhì)量具有一定的差異。

結(jié)果表明，分別引入合格性測試法和主成分分析法兩種模式識別方法，能夠很好地辨別撫順哈什螞油的真?zhèn)巍２捎煤细裥詼y試方法可以鑒別真?zhèn)螕犴樄参浻?，?zhǔn)確率為100%；而采用主成分分析法也可以較好地完成真?zhèn)舞b別，鑒別率為90.04%。研究結(jié)果表明，撫順哈什螞油采用近紅外光譜和模式識別技術(shù)結(jié)合可快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行真?zhèn)舞b別。

3 小結(jié)

通過對樣品進(jìn)行特定處理，可利用高效液相色譜特定吸收對撫順哈什螞油的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別，而利用近紅外光譜和模式識別技術(shù)結(jié)合，則可實(shí)現(xiàn)地理標(biāo)志產(chǎn)品撫順哈什螞油的快速、準(zhǔn)確、無損的真?zhèn)舞b別。

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（責(zé)任編輯 屠 晶）endprint

2.2.2 主成分分析 主成分分析是將原變量進(jìn)行變換，用數(shù)目較少的新變量代替原變量，且新變量能最大限度地表征原變量的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)特征，同時去除無用信息。將撫順哈什螞油和其他產(chǎn)地蛙油近紅外譜圖采用減直線法，因子數(shù)為5，光譜范圍為：7 321～6 574 cm-1、6 105～5 636 cm-1和5 452～4 148 cm-1，進(jìn)行主成分分析，并以第一主成分PC1為X軸，第二主成分PC2為Y軸，作主成分（PCA）得分圖如圖3所示。由圖3中可看出，撫順哈什螞油的樣品在主成分特征空間上的分布較為集中，撫順哈什螞油為聚集在圖中標(biāo)識的橢圓型區(qū)域內(nèi)淺色方塊，而其余深色三角為其他產(chǎn)地蛙油樣品，在主成分特征空間上的分布大部分在真品區(qū)之外，表明其與真品質(zhì)量具有一定的差異。

結(jié)果表明，分別引入合格性測試法和主成分分析法兩種模式識別方法，能夠很好地辨別撫順哈什螞油的真?zhèn)巍２捎煤细裥詼y試方法可以鑒別真?zhèn)螕犴樄参浻?，?zhǔn)確率為100%；而采用主成分分析法也可以較好地完成真?zhèn)舞b別，鑒別率為90.04%。研究結(jié)果表明，撫順哈什螞油采用近紅外光譜和模式識別技術(shù)結(jié)合可快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行真?zhèn)舞b別。

3 小結(jié)

通過對樣品進(jìn)行特定處理，可利用高效液相色譜特定吸收對撫順哈什螞油的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別，而利用近紅外光譜和模式識別技術(shù)結(jié)合，則可實(shí)現(xiàn)地理標(biāo)志產(chǎn)品撫順哈什螞油的快速、準(zhǔn)確、無損的真?zhèn)舞b別。

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2.2.2 主成分分析 主成分分析是將原變量進(jìn)行變換，用數(shù)目較少的新變量代替原變量，且新變量能最大限度地表征原變量的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)特征，同時去除無用信息。將撫順哈什螞油和其他產(chǎn)地蛙油近紅外譜圖采用減直線法，因子數(shù)為5，光譜范圍為：7 321～6 574 cm-1、6 105～5 636 cm-1和5 452～4 148 cm-1，進(jìn)行主成分分析，并以第一主成分PC1為X軸，第二主成分PC2為Y軸，作主成分（PCA）得分圖如圖3所示。由圖3中可看出，撫順哈什螞油的樣品在主成分特征空間上的分布較為集中，撫順哈什螞油為聚集在圖中標(biāo)識的橢圓型區(qū)域內(nèi)淺色方塊，而其余深色三角為其他產(chǎn)地蛙油樣品，在主成分特征空間上的分布大部分在真品區(qū)之外，表明其與真品質(zhì)量具有一定的差異。

結(jié)果表明，分別引入合格性測試法和主成分分析法兩種模式識別方法，能夠很好地辨別撫順哈什螞油的真?zhèn)?。采用合格性測試方法可以鑒別真?zhèn)螕犴樄参浻?，?zhǔn)確率為100%；而采用主成分分析法也可以較好地完成真?zhèn)舞b別，鑒別率為90.04%。研究結(jié)果表明，撫順哈什螞油采用近紅外光譜和模式識別技術(shù)結(jié)合可快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行真?zhèn)舞b別。

3 小結(jié)

通過對樣品進(jìn)行特定處理，可利用高效液相色譜特定吸收對撫順哈什螞油的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別，而利用近紅外光譜和模式識別技術(shù)結(jié)合，則可實(shí)現(xiàn)地理標(biāo)志產(chǎn)品撫順哈什螞油的快速、準(zhǔn)確、無損的真?zhèn)舞b別。

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[10] 劉曉曄，湯曉艷，孫寶忠，等.普通公牛肉和淘汰母牛肉的近紅外光譜鑒別方法[J].食品科學(xué)，2012，33（24）：244-248.

[11] 張 寧，張德權(quán)，李淑榮，等.近紅外光譜結(jié)合SIMCA法溯源羊肉產(chǎn)地的初步研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2008，24（12）：309-312.

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