岳苑

摘要：根據(jù)馬、驢線粒體DNA序列，設(shè)計(jì)并篩選了馬、驢源性特異引物及探針，建立了清真食品中馬、驢源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明，馬、驢源性成分?jǐn)U增產(chǎn)物與數(shù)據(jù)庫(kù)序列完全一致。該方法食品中馬、驢源性成分的最低檢出限分別為1%、0.01%，可以作為清真食品中檢測(cè)馬、驢源性成分的有效方法。

關(guān)鍵詞：實(shí)時(shí)熒光PCR；馬源性；驢源性；MGB探針；清真食品

中圖分類號(hào)：TS251 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）22-5518-05

寧夏回族自治區(qū)是我國(guó)回族主要聚居區(qū)，回族人口222萬(wàn)，約占寧夏總?cè)丝诘?6%，全民信奉伊斯蘭教，在衣著、飲食、起居等方面形成了獨(dú)具特色的風(fēng)俗習(xí)慣。清真食品（HALAL FOOD）是指穆斯林食用的、符合伊斯蘭教律例的食物的統(tǒng)稱。伊斯蘭教飲食律例規(guī)定禽類有素囊者，草食畜類有反芻者，魚(yú)類有鱗、鰓、鰭者，植物中性善無(wú)毒者可食，即牛、羊、駝、鹿、兔等可食，豬、狗等不可食，馬、驢、騾等雖然是食草型動(dòng)物，但因平蹄，屬于異形，也不可食。自死物、血液、酒以及非誦真主之名而宰殺的牲畜、禽類不可食。另外牛羊的內(nèi)外生殖器、睪丸、鼻須、淋巴結(jié)等組織器官也不可食用，以上不可食物統(tǒng)稱為穆斯林飲食禁忌物。清真食品安全是寧夏及我國(guó)2 000多萬(wàn)穆斯林群眾的重要民生問(wèn)題，也是發(fā)展我國(guó)與中東、西亞伊斯蘭國(guó)家多邊關(guān)系的國(guó)策需要。因此，突破清真食品檢測(cè)技術(shù)的瓶頸，加強(qiáng)清真食品的監(jiān)管力度，對(duì)提升我國(guó)清真食品質(zhì)量安全，促進(jìn)清真食品產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展將起到積極作用。

目前，動(dòng)物源性成分鑒別的主要方法有物理、化學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法[1]，其中分子生物學(xué)的方法以其靈敏、快速的特點(diǎn)，成為近幾年研究的重點(diǎn)。英國(guó)研究者利用熒光PCR技術(shù)檢測(cè)豬、牛、羊、雞、火雞動(dòng)物源性成分，靈敏度低于0.1%[2]。西班牙技術(shù)人員采用普通PCR技術(shù)鑒別禽類成分，其中包括雞、火雞、野鴨和鵝[3]。國(guó)內(nèi)已有關(guān)于豬、牛、羊、兔、馬、驢、魚(yú)[4-7]動(dòng)物源性成分分析的報(bào)道，尚缺乏實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)馬、驢源性成分的方法，同時(shí)鮮見(jiàn)清真食品禁忌物成分檢測(cè)的報(bào)道。本試驗(yàn)選擇馬和驢線粒體DNA特定片段設(shè)計(jì)引物和探針，建立清真食品及衍生產(chǎn)品中馬、驢源性成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，旨在靈敏、準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)出馬、驢源性成分，規(guī)范清真食品市場(chǎng)。

1 材料與方法

1.1 肉制品

肉制品包括馬肉、驢肉、豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉、魚(yú)肉。所有樣品保證質(zhì)量，防止不同肉制品的交叉污染。

1.2 主要試劑與儀器

動(dòng)物源性基因組DNA提取試劑盒（TAKARA公司），Platinum 定量PCR SuperMix-UDG（Invitrogen公司），PCR擴(kuò)增純化試劑盒（Promager公司），pEASYPM-T1 cloning kit（Transgene公司），DH5α感受態(tài)細(xì)胞（Transgene公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Eppendorf公司），高速冷凍離心機(jī)（HTACHI公司），恒溫加熱器（TAITEC公司）。

1.3 模板制備

采用TAKARA公司基因組DNA提取試劑盒，按其說(shuō)明分別提取動(dòng)物基因組DNA。稱取10 mg樣品，加入到基因組DNA提取試劑盒中，充分搗碎，70 ℃加熱10 min，期間輕彈離心管2-3次。在4 ℃、12 000 r/min下離心10 min，吸取上清液200 μL于新的離心管中備用。

1.4 引物、探針設(shè)計(jì)與合成

選擇細(xì)胞色素b基因設(shè)計(jì)馬和驢的特異性引物和探針，擴(kuò)增片段分別為69 bp和119 bp。引物序列見(jiàn)表1。此外，為了監(jiān)控PCR反應(yīng)是否正常進(jìn)行以及防止假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物16sRNA的保守區(qū)域設(shè)計(jì)了通用上下游引物，大小為74 bp。

1.5 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)

熒光PCR反應(yīng)體系為40 μL，各組分含量分別為PCR Mix25 μL，10 μmol/L引物各2 μmol/L，5 μM探針2 μL，模板DNA 100～200 ng。馬源性成分?jǐn)U增條件為50 ℃保溫2 min，95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃ 15 s、55 ℃ 45 s進(jìn)行 40個(gè)循環(huán)。驢源性成分?jǐn)U增條件為50 ℃保溫2 min，95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃15 s、52℃ 45 s進(jìn)行 40個(gè)循環(huán)。目標(biāo)DNA和內(nèi)參照同時(shí)擴(kuò)增。

1.6 特異性試驗(yàn)

采用提取的豬、牛、羊、雞、鴨、魚(yú)DNA作對(duì)照，與提取的馬、驢DNA同時(shí)進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增。陽(yáng)性PCR產(chǎn)物使用Promager公司純化回收試劑盒（Wizard PCR preps DNA Purification System）回收PCR產(chǎn)物，純化后連接克隆載體pEASYTM-T1，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)陽(yáng)性的菌液送去測(cè)序。

1.7 重復(fù)性與穩(wěn)定性試驗(yàn)

用馬肉和驢肉提取的DNA為模板，按照“1.5”所述的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，同一模板同時(shí)進(jìn)行3次反應(yīng)，每隔一天做一次，共重復(fù)15次，研究所建立體系的穩(wěn)定性。

1.8 靈敏性試驗(yàn)

將驢肉、馬肉、魚(yú)肉切成薄片分別置于90 ℃的烘箱中烘烤24 h，然后將樣品分別研磨。向魚(yú)粉中加入驢肉粉使其含量分別達(dá)到1%、0.1%、0.01%，向魚(yú)粉中加入馬肉粉使其含量分別達(dá)到1%、0.1%、0.01%，充分混勻，提取DNA作為模版，按照“1.5”所述的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。確定檢出限含量后，重復(fù)8次確定檢出限的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬源性成分特異性試驗(yàn)

用設(shè)計(jì)的馬引物和探針?lè)謩e對(duì)馬、豬、牛、羊、雞、鴨、魚(yú)、驢8種樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，部分結(jié)果如圖1A（圖中Ct值較小的曲線為內(nèi)參照），本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的馬引物和探針能夠擴(kuò)增出馬源性成分樣品，且對(duì)上述其他物種無(wú)擴(kuò)增，證明本研究設(shè)計(jì)的馬引物和探針具有良好的特異性。

2.2 驢源性成分特異性試驗(yàn)

用設(shè)計(jì)的驢引物和探針?lè)謩e對(duì)驢、豬、牛、羊、雞、鴨、魚(yú)、馬8種樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，部分結(jié)果如圖1B（圖中Ct值較小的曲線為內(nèi)參照），本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的驢引物和探針可擴(kuò)增出驢源性成分樣品，且對(duì)上述其他物種無(wú)擴(kuò)增，證明本研究設(shè)計(jì)的驢引物和探針具有良好的特異性。

2.3 馬、驢源性成分?jǐn)U增片段測(cè)序結(jié)果

將經(jīng)過(guò)PCR鑒定正確的重組菌活化后，進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，插入載體的DNA序列與已知序列相似度達(dá)100%。

2.4 PCR反應(yīng)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

將馬肉和驢肉提取的DNA作為模板，按照“1.5”所述的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，同一模板同時(shí)進(jìn)行3次反應(yīng)，每隔一天做一次，共重復(fù)15次，結(jié)果見(jiàn)表2。馬、驢源性成分Ct值的平均值為24.24、21.67，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.28、0.29，變異系數(shù)為1.17%、1.34%。說(shuō)明本試驗(yàn)所建立的體系較穩(wěn)定。

2.5 PCR反應(yīng)靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

馬源性樣品實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏性試驗(yàn)結(jié)果如圖2A，Ct值如表3所示。當(dāng)馬肉粉稀釋至含量為0.01%時(shí)，無(wú)典型擴(kuò)增曲線。當(dāng)馬肉粉稀釋至含量為1%和0.1%時(shí)，擴(kuò)增結(jié)果Ct值的平均值分別為34.71和37.52，表明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物可以檢測(cè)最低含量為1%的單一馬源性成分。

驢源性樣品實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏性試驗(yàn)結(jié)果如圖2B，Ct值如表3所示。當(dāng)驢肉粉稀釋至含量為0.01%時(shí)，呈典型擴(kuò)增曲線，Ct值的平均值為34.86；當(dāng)驢肉粉稀釋至含量為0.1%時(shí)，呈典型的擴(kuò)增曲線，Ct值的平均值為31.20，表明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物可以檢測(cè)最低含量為0.01%的單一驢源性成分。馬、驢源性成分的檢出限均高于陳穎等[1]用普通PCR方法檢測(cè)的結(jié)果。

確定檢出限含量后，重復(fù)8次試驗(yàn)，說(shuō)明本試驗(yàn)檢出限擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定（表3）。

3 小結(jié)與討論

3.1 目的基因的選擇

線粒體DNA（mtDNA）種內(nèi)遺傳穩(wěn)定，種間高度變異且無(wú)組織特異性，屬母系遺傳，普遍存在于真核生物中。mtDNA相對(duì)細(xì)胞核DNA作為物種鑒定的靶序列具有以下優(yōu)點(diǎn)：①mtDNA具有廣泛的種內(nèi)和種間多樣性，比核DNA進(jìn)化速度快，適于親緣相近物種的鑒別。②每個(gè)細(xì)胞中含1 000個(gè)線粒體，每個(gè)線粒體含2～6個(gè)環(huán)狀DNA，在數(shù)量上遠(yuǎn)超過(guò)核DNA，適于加工樣品的分析。③基因片段長(zhǎng)度足夠區(qū)別同屬生物，同時(shí)相對(duì)核DNA來(lái)說(shuō)也足夠短，可以從嚴(yán)重降解的DNA中擴(kuò)增出來(lái)。④mtDNA在不同的物種中具有較高的變異性。

馬和驢都具備馬屬動(dòng)物的共同特征，親緣關(guān)系近，具有高度同源的序列。要準(zhǔn)確靈敏地區(qū)分這兩種動(dòng)物源性成分是本試驗(yàn)的難點(diǎn)之一。我們選擇馬、驢線粒體DNA上的細(xì)胞色素b基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針，通過(guò)特異性、重復(fù)性和靈敏度試驗(yàn)表明該引物和探針能夠區(qū)分馬源性和驢源性以及其他六種常見(jiàn)的動(dòng)物源性成分（豬、牛、羊、雞、鴨、魚(yú)），具有很好的特異性。

3.2 擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度的選擇

肉制品放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或經(jīng)高溫加工，DNA片段會(huì)發(fā)生降解。本試驗(yàn)選擇的擴(kuò)增片段較短（分別為69 bp和119 bp），即使經(jīng)高溫、高壓處理，模板DNA降解，但選取的目的片段依然存在，從而避免了假陰性的結(jié)果。此外，為了驗(yàn)證本試驗(yàn)的靈敏度，我們模仿肉骨粉的制作工藝，對(duì)樣本90 ℃烘烤24 h后研磨制成干粉，與魚(yú)粉按比例混合后提取DNA進(jìn)行靈敏度的試驗(yàn)，結(jié)果顯示馬源性成分的最低檢出限為1%，驢源性成分的最低檢出限為0.01%，表明本試驗(yàn)確定的引物和探針具有很高的靈敏度。

3.3 MGB探針

MGB（Minor Groove Binder，小型凹槽結(jié)合物）可結(jié)合在DNA雙螺旋的小溝里，從而起到穩(wěn)定DNA雙螺旋的作用[8]，是在普通的Taq-Man探針基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的探針，因?yàn)?端MGB基團(tuán)的存在，大大提高了探針與模板結(jié)合的退火溫度，從而提高了雜交的特異性。TaqMan-MGB探針具有熒光本底低、分辨率更高、雜交特異性更強(qiáng)、重現(xiàn)性好、探針長(zhǎng)度縮短等優(yōu)點(diǎn)[9]，不僅解決了PCR污染問(wèn)題，而且自動(dòng)化程度高，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)控，不存在非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象，已成為目前國(guó)際上公認(rèn)的核酸分子定性、定量檢測(cè)方法。

近年來(lái)，我國(guó)清真食品及衍生產(chǎn)品新品種大幅度增加，規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化程度也大大提升。但由于我國(guó)清真認(rèn)證、監(jiān)管、檢測(cè)技術(shù)滯后，出現(xiàn)大量使穆斯林震驚的事件：如在牛羊飼料中添加豬骨粉，在食品中添加豬油、血粉等，許多肉品添加劑生產(chǎn)原料來(lái)自穆斯林禁忌物，甚至以騾馬肉冒充牛羊肉，諸如此類事件，使廣大穆斯林的內(nèi)心受到極大傷害。清真食品的質(zhì)量安全問(wèn)題不僅關(guān)乎我國(guó)穆斯林地區(qū)經(jīng)濟(jì)的健康發(fā)展，也關(guān)系到穆斯林身心健康，因此是一個(gè)重大的民生工程。本試驗(yàn)針對(duì)清真食品及衍生產(chǎn)品質(zhì)量安全的檢測(cè)技術(shù)難點(diǎn)進(jìn)行突破，采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)動(dòng)物源性成分。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)相當(dāng)于定性PCR與分子雜交的結(jié)合，它能區(qū)別只有少數(shù)堿基差異的DNA序列，具有高特異性和高精確性的優(yōu)點(diǎn)[10]。而且實(shí)時(shí)熒光PCR是在封閉的體系中進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束無(wú)需進(jìn)行電泳，避免污染和危害，縮短了檢測(cè)時(shí)間。該方法能夠?yàn)榍逭媸称芳把苌a(chǎn)品的質(zhì)量控制和質(zhì)量監(jiān)督提供適用的技術(shù)依據(jù)，為保證我區(qū)清真食品及衍生產(chǎn)品的質(zhì)量，保障食品安全奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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（責(zé)任編輯 彭西甜）

2.2 驢源性成分特異性試驗(yàn)

用設(shè)計(jì)的驢引物和探針?lè)謩e對(duì)驢、豬、牛、羊、雞、鴨、魚(yú)、馬8種樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，部分結(jié)果如圖1B（圖中Ct值較小的曲線為內(nèi)參照），本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的驢引物和探針可擴(kuò)增出驢源性成分樣品，且對(duì)上述其他物種無(wú)擴(kuò)增，證明本研究設(shè)計(jì)的驢引物和探針具有良好的特異性。

2.3 馬、驢源性成分?jǐn)U增片段測(cè)序結(jié)果

將經(jīng)過(guò)PCR鑒定正確的重組菌活化后，進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，插入載體的DNA序列與已知序列相似度達(dá)100%。

2.4 PCR反應(yīng)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

將馬肉和驢肉提取的DNA作為模板，按照“1.5”所述的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，同一模板同時(shí)進(jìn)行3次反應(yīng)，每隔一天做一次，共重復(fù)15次，結(jié)果見(jiàn)表2。馬、驢源性成分Ct值的平均值為24.24、21.67，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.28、0.29，變異系數(shù)為1.17%、1.34%。說(shuō)明本試驗(yàn)所建立的體系較穩(wěn)定。

2.5 PCR反應(yīng)靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

馬源性樣品實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏性試驗(yàn)結(jié)果如圖2A，Ct值如表3所示。當(dāng)馬肉粉稀釋至含量為0.01%時(shí)，無(wú)典型擴(kuò)增曲線。當(dāng)馬肉粉稀釋至含量為1%和0.1%時(shí)，擴(kuò)增結(jié)果Ct值的平均值分別為34.71和37.52，表明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物可以檢測(cè)最低含量為1%的單一馬源性成分。

驢源性樣品實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏性試驗(yàn)結(jié)果如圖2B，Ct值如表3所示。當(dāng)驢肉粉稀釋至含量為0.01%時(shí)，呈典型擴(kuò)增曲線，Ct值的平均值為34.86；當(dāng)驢肉粉稀釋至含量為0.1%時(shí)，呈典型的擴(kuò)增曲線，Ct值的平均值為31.20，表明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物可以檢測(cè)最低含量為0.01%的單一驢源性成分。馬、驢源性成分的檢出限均高于陳穎等[1]用普通PCR方法檢測(cè)的結(jié)果。

確定檢出限含量后，重復(fù)8次試驗(yàn)，說(shuō)明本試驗(yàn)檢出限擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定（表3）。

3 小結(jié)與討論

3.1 目的基因的選擇

線粒體DNA（mtDNA）種內(nèi)遺傳穩(wěn)定，種間高度變異且無(wú)組織特異性，屬母系遺傳，普遍存在于真核生物中。mtDNA相對(duì)細(xì)胞核DNA作為物種鑒定的靶序列具有以下優(yōu)點(diǎn)：①mtDNA具有廣泛的種內(nèi)和種間多樣性，比核DNA進(jìn)化速度快，適于親緣相近物種的鑒別。②每個(gè)細(xì)胞中含1 000個(gè)線粒體，每個(gè)線粒體含2～6個(gè)環(huán)狀DNA，在數(shù)量上遠(yuǎn)超過(guò)核DNA，適于加工樣品的分析。③基因片段長(zhǎng)度足夠區(qū)別同屬生物，同時(shí)相對(duì)核DNA來(lái)說(shuō)也足夠短，可以從嚴(yán)重降解的DNA中擴(kuò)增出來(lái)。④mtDNA在不同的物種中具有較高的變異性。

馬和驢都具備馬屬動(dòng)物的共同特征，親緣關(guān)系近，具有高度同源的序列。要準(zhǔn)確靈敏地區(qū)分這兩種動(dòng)物源性成分是本試驗(yàn)的難點(diǎn)之一。我們選擇馬、驢線粒體DNA上的細(xì)胞色素b基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針，通過(guò)特異性、重復(fù)性和靈敏度試驗(yàn)表明該引物和探針能夠區(qū)分馬源性和驢源性以及其他六種常見(jiàn)的動(dòng)物源性成分（豬、牛、羊、雞、鴨、魚(yú)），具有很好的特異性。

3.2 擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度的選擇

肉制品放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或經(jīng)高溫加工，DNA片段會(huì)發(fā)生降解。本試驗(yàn)選擇的擴(kuò)增片段較短（分別為69 bp和119 bp），即使經(jīng)高溫、高壓處理，模板DNA降解，但選取的目的片段依然存在，從而避免了假陰性的結(jié)果。此外，為了驗(yàn)證本試驗(yàn)的靈敏度，我們模仿肉骨粉的制作工藝，對(duì)樣本90 ℃烘烤24 h后研磨制成干粉，與魚(yú)粉按比例混合后提取DNA進(jìn)行靈敏度的試驗(yàn)，結(jié)果顯示馬源性成分的最低檢出限為1%，驢源性成分的最低檢出限為0.01%，表明本試驗(yàn)確定的引物和探針具有很高的靈敏度。

3.3 MGB探針

MGB（Minor Groove Binder，小型凹槽結(jié)合物）可結(jié)合在DNA雙螺旋的小溝里，從而起到穩(wěn)定DNA雙螺旋的作用[8]，是在普通的Taq-Man探針基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的探針，因?yàn)?端MGB基團(tuán)的存在，大大提高了探針與模板結(jié)合的退火溫度，從而提高了雜交的特異性。TaqMan-MGB探針具有熒光本底低、分辨率更高、雜交特異性更強(qiáng)、重現(xiàn)性好、探針長(zhǎng)度縮短等優(yōu)點(diǎn)[9]，不僅解決了PCR污染問(wèn)題，而且自動(dòng)化程度高，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)控，不存在非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象，已成為目前國(guó)際上公認(rèn)的核酸分子定性、定量檢測(cè)方法。

近年來(lái)，我國(guó)清真食品及衍生產(chǎn)品新品種大幅度增加，規(guī)?；a(chǎn)業(yè)化程度也大大提升。但由于我國(guó)清真認(rèn)證、監(jiān)管、檢測(cè)技術(shù)滯后，出現(xiàn)大量使穆斯林震驚的事件：如在牛羊飼料中添加豬骨粉，在食品中添加豬油、血粉等，許多肉品添加劑生產(chǎn)原料來(lái)自穆斯林禁忌物，甚至以騾馬肉冒充牛羊肉，諸如此類事件，使廣大穆斯林的內(nèi)心受到極大傷害。清真食品的質(zhì)量安全問(wèn)題不僅關(guān)乎我國(guó)穆斯林地區(qū)經(jīng)濟(jì)的健康發(fā)展，也關(guān)系到穆斯林身心健康，因此是一個(gè)重大的民生工程。本試驗(yàn)針對(duì)清真食品及衍生產(chǎn)品質(zhì)量安全的檢測(cè)技術(shù)難點(diǎn)進(jìn)行突破，采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)動(dòng)物源性成分。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)相當(dāng)于定性PCR與分子雜交的結(jié)合，它能區(qū)別只有少數(shù)堿基差異的DNA序列，具有高特異性和高精確性的優(yōu)點(diǎn)[10]。而且實(shí)時(shí)熒光PCR是在封閉的體系中進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束無(wú)需進(jìn)行電泳，避免污染和危害，縮短了檢測(cè)時(shí)間。該方法能夠?yàn)榍逭媸称芳把苌a(chǎn)品的質(zhì)量控制和質(zhì)量監(jiān)督提供適用的技術(shù)依據(jù)，為保證我區(qū)清真食品及衍生產(chǎn)品的質(zhì)量，保障食品安全奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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[10] 劉彥泓，穆 春，孫 屏，等.實(shí)時(shí)熒光PCR和常規(guī)PCR方法檢測(cè)飼料中雞源性成分[J].飼料工業(yè)，2010（7）：45-47.

（責(zé)任編輯 彭西甜）

2.2 驢源性成分特異性試驗(yàn)

用設(shè)計(jì)的驢引物和探針?lè)謩e對(duì)驢、豬、牛、羊、雞、鴨、魚(yú)、馬8種樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，部分結(jié)果如圖1B（圖中Ct值較小的曲線為內(nèi)參照），本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的驢引物和探針可擴(kuò)增出驢源性成分樣品，且對(duì)上述其他物種無(wú)擴(kuò)增，證明本研究設(shè)計(jì)的驢引物和探針具有良好的特異性。

2.3 馬、驢源性成分?jǐn)U增片段測(cè)序結(jié)果

將經(jīng)過(guò)PCR鑒定正確的重組菌活化后，進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，插入載體的DNA序列與已知序列相似度達(dá)100%。

2.4 PCR反應(yīng)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

將馬肉和驢肉提取的DNA作為模板，按照“1.5”所述的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，同一模板同時(shí)進(jìn)行3次反應(yīng)，每隔一天做一次，共重復(fù)15次，結(jié)果見(jiàn)表2。馬、驢源性成分Ct值的平均值為24.24、21.67，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.28、0.29，變異系數(shù)為1.17%、1.34%。說(shuō)明本試驗(yàn)所建立的體系較穩(wěn)定。

2.5 PCR反應(yīng)靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

馬源性樣品實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏性試驗(yàn)結(jié)果如圖2A，Ct值如表3所示。當(dāng)馬肉粉稀釋至含量為0.01%時(shí)，無(wú)典型擴(kuò)增曲線。當(dāng)馬肉粉稀釋至含量為1%和0.1%時(shí)，擴(kuò)增結(jié)果Ct值的平均值分別為34.71和37.52，表明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物可以檢測(cè)最低含量為1%的單一馬源性成分。

驢源性樣品實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏性試驗(yàn)結(jié)果如圖2B，Ct值如表3所示。當(dāng)驢肉粉稀釋至含量為0.01%時(shí)，呈典型擴(kuò)增曲線，Ct值的平均值為34.86；當(dāng)驢肉粉稀釋至含量為0.1%時(shí)，呈典型的擴(kuò)增曲線，Ct值的平均值為31.20，表明本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物可以檢測(cè)最低含量為0.01%的單一驢源性成分。馬、驢源性成分的檢出限均高于陳穎等[1]用普通PCR方法檢測(cè)的結(jié)果。

確定檢出限含量后，重復(fù)8次試驗(yàn)，說(shuō)明本試驗(yàn)檢出限擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定（表3）。

3 小結(jié)與討論

3.1 目的基因的選擇

線粒體DNA（mtDNA）種內(nèi)遺傳穩(wěn)定，種間高度變異且無(wú)組織特異性，屬母系遺傳，普遍存在于真核生物中。mtDNA相對(duì)細(xì)胞核DNA作為物種鑒定的靶序列具有以下優(yōu)點(diǎn)：①mtDNA具有廣泛的種內(nèi)和種間多樣性，比核DNA進(jìn)化速度快，適于親緣相近物種的鑒別。②每個(gè)細(xì)胞中含1 000個(gè)線粒體，每個(gè)線粒體含2～6個(gè)環(huán)狀DNA，在數(shù)量上遠(yuǎn)超過(guò)核DNA，適于加工樣品的分析。③基因片段長(zhǎng)度足夠區(qū)別同屬生物，同時(shí)相對(duì)核DNA來(lái)說(shuō)也足夠短，可以從嚴(yán)重降解的DNA中擴(kuò)增出來(lái)。④mtDNA在不同的物種中具有較高的變異性。

馬和驢都具備馬屬動(dòng)物的共同特征，親緣關(guān)系近，具有高度同源的序列。要準(zhǔn)確靈敏地區(qū)分這兩種動(dòng)物源性成分是本試驗(yàn)的難點(diǎn)之一。我們選擇馬、驢線粒體DNA上的細(xì)胞色素b基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針，通過(guò)特異性、重復(fù)性和靈敏度試驗(yàn)表明該引物和探針能夠區(qū)分馬源性和驢源性以及其他六種常見(jiàn)的動(dòng)物源性成分（豬、牛、羊、雞、鴨、魚(yú)），具有很好的特異性。

3.2 擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度的選擇

肉制品放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或經(jīng)高溫加工，DNA片段會(huì)發(fā)生降解。本試驗(yàn)選擇的擴(kuò)增片段較短（分別為69 bp和119 bp），即使經(jīng)高溫、高壓處理，模板DNA降解，但選取的目的片段依然存在，從而避免了假陰性的結(jié)果。此外，為了驗(yàn)證本試驗(yàn)的靈敏度，我們模仿肉骨粉的制作工藝，對(duì)樣本90 ℃烘烤24 h后研磨制成干粉，與魚(yú)粉按比例混合后提取DNA進(jìn)行靈敏度的試驗(yàn)，結(jié)果顯示馬源性成分的最低檢出限為1%，驢源性成分的最低檢出限為0.01%，表明本試驗(yàn)確定的引物和探針具有很高的靈敏度。

3.3 MGB探針

MGB（Minor Groove Binder，小型凹槽結(jié)合物）可結(jié)合在DNA雙螺旋的小溝里，從而起到穩(wěn)定DNA雙螺旋的作用[8]，是在普通的Taq-Man探針基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的探針，因?yàn)?端MGB基團(tuán)的存在，大大提高了探針與模板結(jié)合的退火溫度，從而提高了雜交的特異性。TaqMan-MGB探針具有熒光本底低、分辨率更高、雜交特異性更強(qiáng)、重現(xiàn)性好、探針長(zhǎng)度縮短等優(yōu)點(diǎn)[9]，不僅解決了PCR污染問(wèn)題，而且自動(dòng)化程度高，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)控，不存在非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象，已成為目前國(guó)際上公認(rèn)的核酸分子定性、定量檢測(cè)方法。

近年來(lái)，我國(guó)清真食品及衍生產(chǎn)品新品種大幅度增加，規(guī)?；a(chǎn)業(yè)化程度也大大提升。但由于我國(guó)清真認(rèn)證、監(jiān)管、檢測(cè)技術(shù)滯后，出現(xiàn)大量使穆斯林震驚的事件：如在牛羊飼料中添加豬骨粉，在食品中添加豬油、血粉等，許多肉品添加劑生產(chǎn)原料來(lái)自穆斯林禁忌物，甚至以騾馬肉冒充牛羊肉，諸如此類事件，使廣大穆斯林的內(nèi)心受到極大傷害。清真食品的質(zhì)量安全問(wèn)題不僅關(guān)乎我國(guó)穆斯林地區(qū)經(jīng)濟(jì)的健康發(fā)展，也關(guān)系到穆斯林身心健康，因此是一個(gè)重大的民生工程。本試驗(yàn)針對(duì)清真食品及衍生產(chǎn)品質(zhì)量安全的檢測(cè)技術(shù)難點(diǎn)進(jìn)行突破，采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)動(dòng)物源性成分。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)相當(dāng)于定性PCR與分子雜交的結(jié)合，它能區(qū)別只有少數(shù)堿基差異的DNA序列，具有高特異性和高精確性的優(yōu)點(diǎn)[10]。而且實(shí)時(shí)熒光PCR是在封閉的體系中進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束無(wú)需進(jìn)行電泳，避免污染和危害，縮短了檢測(cè)時(shí)間。該方法能夠?yàn)榍逭媸称芳把苌a(chǎn)品的質(zhì)量控制和質(zhì)量監(jiān)督提供適用的技術(shù)依據(jù)，為保證我區(qū)清真食品及衍生產(chǎn)品的質(zhì)量，保障食品安全奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 彭西甜）