馬東方+方正武+邱先進(jìn)+等

摘要：中梁16具有適應(yīng)性廣、抗條銹性強(qiáng)等許多優(yōu)良的生物學(xué)特性。為了給抗病育種和小麥條銹病的區(qū)域治理提供參考， 利用中國(guó)當(dāng)前流行的條銹菌小種CYR29對(duì)中梁16、銘賢169及其雜交群體進(jìn)行抗條銹性遺傳分析， 并對(duì)其抗條銹基因進(jìn)行SSR分子標(biāo)記。結(jié)果表明， 中梁16對(duì)CYR29小種具有良好的抗性， 由1對(duì)顯性基因控制， 暫命名為YrZh16。該基因與位于小麥2AS染色體上的5個(gè)SSR位點(diǎn)Xbarc124、Xbarc212、Xwmc177、Xwmc602和Xwmc827連鎖， 遺傳距離跨度從5.4 cM到16.9 cM。系譜分析該基因可能來(lái)自水源11。與已定位于2A染色體上暫命名抗條銹病基因的比較表明，YrZh16可能是一個(gè)抗條銹病的新基因。

關(guān)鍵詞：中梁16；小麥條銹病；遺傳分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S512.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）22-5351-04

小麥（Triticum aestivum）是一種在世界范圍內(nèi)廣泛種植的禾本科植物，種植面積多于水稻。小麥條銹病是影響小麥生產(chǎn)最重要的病害之一，該病害是由條形柄銹菌小麥專(zhuān)化型（Puccinia striiformis f.sp. tritici）引起的世界性病害，在低溫和潮濕環(huán)境下易發(fā)生，從小麥一葉期到成熟只要植物仍然是綠色都可以發(fā)生感染[1]。該病菌可隨氣流高空遠(yuǎn)距離傳播，具有發(fā)病范圍廣、流行頻率高等特點(diǎn)。雖然農(nóng)藥的大面積及時(shí)使用可以控制該病害，但要投入大量的人力、物力和財(cái)力，而且污染環(huán)境。國(guó)內(nèi)外大量的研究表明，培育和推廣抗病小麥品種是控制這一病害最有效、經(jīng)濟(jì)且環(huán)保的方法[2]。然而，小麥條銹菌群體毒性結(jié)構(gòu)復(fù)雜，新毒性小種不斷形成，由于利用小麥抗病類(lèi)型單一，促進(jìn)了新生理小種的形成并發(fā)展成為優(yōu)勢(shì)小種，致使小麥條銹病周期性流行。因此，不斷地尋找、鑒定、引進(jìn)新的抗條銹病基因，并對(duì)去抗條銹的遺傳特點(diǎn)進(jìn)行研究，增加抗病基因的多樣性，是控制小麥條銹病發(fā)生流行的迫切任務(wù)[3]。

至今已有51個(gè)位點(diǎn)上的54個(gè)抗條銹基因（Yr1～Yr54）被正式命名[4]，另外還有數(shù)十個(gè)被臨時(shí)命名的基因[5]，這些基因大部分表現(xiàn)小種專(zhuān)化性。分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，為抗病基因的檢測(cè)、標(biāo)記與定位提供了更為快捷的手段，其中SSR（Simple sequence repeat）標(biāo)記在小麥抗條銹病基因定位和分子作圖中被廣泛應(yīng)用，大部分已正式命名小麥抗條銹病基因均已獲得與其緊密連鎖的SSR標(biāo)記。

中梁16（水源11/山前麥）是甘肅省天水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選育的具有相對(duì)持久抗條銹病的冬小麥品種，綜合農(nóng)藝性狀好。本研究旨在明確中梁16抗條銹遺傳規(guī)律，挖掘其抗病基因，并獲得與其緊密連鎖的SSR標(biāo)記，獲得的分子標(biāo)記將為小麥抗條銹病分子輔助育種提供有效的工具。

1 材料和方法

1.1 植物材料和條銹菌小種

用于條銹菌接菌測(cè)試的小麥品種包括：中梁16及其與銘賢169雜交后代F1、F2、F2∶3、BC1代群體。中梁16品種由甘肅省天水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。

供試小麥條銹菌生理小種為：CYR29。菌種通過(guò)單孢分離法獲得，并在中國(guó)鑒別寄主上重新鑒定確認(rèn)。

1.2 苗期抗條銹病遺傳分析

將親本、F1代、F2代、BC1代以及F2∶3家系小麥種子用1∶100的雙氧水溶液浸泡消毒，蒸餾水中催芽24 h，待萌發(fā)后播種到直徑10 cm的小花盆中，每花盆播種15～20粒，置于溫室按常規(guī)方法培養(yǎng)。在供試小麥幼苗第1葉片充分展開(kāi)，第2葉片露尖時(shí)用手指蘸水脫去葉表面的蠟質(zhì)層，同時(shí)用蒸餾水配制條銹菌夏孢子懸浮液，用接種針蘸取懸浮液涂抹于葉片正面。接種完成后，保濕24 h（黑暗、10 ℃）后轉(zhuǎn)入溫室內(nèi)潛育發(fā)病[溫度為15～17 ℃（晝）/10～12℃（夜），光照周期16 h（晝）/8h（夜）]，并采用生物鏑燈增加光照強(qiáng)度（光強(qiáng)9 000 lx）。約14 d后待感病對(duì)照銘賢169充分發(fā)病時(shí)開(kāi)始調(diào)查結(jié)果，反應(yīng)型調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)分為11級(jí)， 即 0、0；、0；+、1、1+、2、2+、3-、3、3+、4。其中0～2+為抗病類(lèi)型， 3-～4為感病類(lèi)型[6]。統(tǒng)計(jì)雙親、雜交后代各株系的抗感分離比例， 用卡方檢驗(yàn)法對(duì)分離后代進(jìn)行分析， 明確供試品種對(duì)特定小種抗條銹性的基因數(shù)目及基因間關(guān)系。

1.3 基因組DNA的提取和抗、感池的構(gòu)建

基因組DNA提取用CTAB法[7]。參考Michelmore等[8]提出的抗、感池建立方法，將F2代群體的10株高抗單株DNA、10株高感單株DNA分別等量混合構(gòu)成抗病基因池（BR）和感病基因池（BS）。構(gòu)建抗感池的單株均經(jīng)過(guò)F2∶3家系驗(yàn)證其純合性。

1.4 SSR標(biāo)記篩選和遺傳作圖

根據(jù)http：//wheat.pw.usda.gov公布的小麥SSR引物序列，由上海Invitrogen生命技術(shù)公司合成21條染色體上420對(duì)SSR引物。對(duì)中梁16、銘賢169、抗病基因池、感病基因池和F2代群體的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，篩選多態(tài)性引物。擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，硝酸銀染色后顯影，照相并保存圖像。篩選與抗病親本連鎖的標(biāo)記，進(jìn)而用MAPMAKER 3.0b軟件計(jì)算各標(biāo)記位點(diǎn)與目的基因的遺傳距離，最后用MapDraw V2.0軟件繪制連鎖圖[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗條銹性鑒定

苗期接種鑒定表明，中梁16和水源11對(duì)CYR29表現(xiàn)良好的抗銹性，反應(yīng)型為近免疫（IT 0；）。山前麥和感病對(duì)照品種銘賢169對(duì)CYR29均表現(xiàn)高度感病反應(yīng)（IT 4）。推斷中梁16的抗條銹病基因可能來(lái)自于水源11。

2.2 抗條銹性遺傳分析

接種CYR29時(shí)，中梁16與銘賢169雜交的F1代15個(gè)植株均表現(xiàn)高抗，BC1代12株抗病，13株感病，經(jīng)卡方檢測(cè)符合1∶1的分離比；反交組合F2代中，抗病植株117株，感病植株44株，符合3∶1的分離比例（χ2=0.35，P=0.49），對(duì)應(yīng)的F2∶3家系中，純抗家系37個(gè)，抗感分離家系79個(gè)，純感家系43個(gè)，分離比例符合1∶2∶1（χ2=0.46，P=0.79）（表1）。上述結(jié)果表明中梁16對(duì)CYR29的抗病性由1對(duì)顯性基因控制，暫命名為YrZh16。以F2群體的161個(gè)單株構(gòu)建作圖群體，對(duì)抗條銹病基因進(jìn)行SSR標(biāo)記。

2.3 YrZh16的SSR標(biāo)記定位

選擇小麥21條染色體上的420對(duì)SSR引物對(duì)中梁16、銘賢169、抗病池及感病池進(jìn)行多態(tài)性引物的篩選。結(jié)果2AS上的5對(duì)引物 （Xbarc124、Xbarc212、Xwmc177、Xwmc602和Xwmc827） 在中梁16、銘賢169及抗感池間能擴(kuò)增出穩(wěn)定的多態(tài)性片段。篩選到的5對(duì)多態(tài)性引物再對(duì)小群體進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示均擴(kuò)增出一致的多態(tài)性，推測(cè)這5個(gè)標(biāo)記與YrZh16連鎖。圖1為SSR引物Xbarc177和Xbarc212在親本、抗感池、部分F2代單株中的擴(kuò)增結(jié)果。

2.4 連鎖遺傳分析

根據(jù)F2分離群體及F2∶3家系反應(yīng)型，確定F2單株的抗感基因型。以2AS上的5對(duì)多態(tài)性引物對(duì)銘賢169×中梁16 F2代分離群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示這些位點(diǎn)與YrZh16有明顯的連鎖關(guān)系（表2）。用MAPMAKER 3.0b軟件進(jìn)行連鎖分析， Xbarc124、Xbarc212、Xwmc177、Xwmc602和Xwmc827與抗條銹基因的遺傳距離分別為13.0、5.4、6.6、9.8 和16.9 cM，總跨度為51.7 cM。參照Somers等[10]報(bào)道的小麥染色體上SSR遺傳圖譜， 根據(jù)YrZh16與所獲得5個(gè)連鎖標(biāo)記之間的關(guān)系可知，YrZh16位于小麥染色體2AS上， 且位于Xbarc212和Xwmc177之間。據(jù)此繪制了中梁16中抗條銹病基因YrZh16遺傳連鎖圖 （圖2）。

3 討論

甘肅隴南地區(qū)是中國(guó)小麥條銹病菌越夏異變區(qū)，超過(guò)80%的條銹菌新小種首先在甘肅隴南地區(qū)被發(fā)現(xiàn)，然后蔓延至其他地區(qū)。中梁16在隴南地區(qū)已種植多年，對(duì)穩(wěn)定小麥條銹菌種群、減輕麥區(qū)菌源壓力等方面有不可忽視的作用。在本試驗(yàn)中，課題組鑒定了中梁16對(duì)條銹菌CYR29具有良好的抗病性，并對(duì)中梁16所含的抗銹基因YrZh16進(jìn)行了分子定位。本研究發(fā)現(xiàn)普通小麥品種中梁16對(duì)中國(guó)優(yōu)勢(shì)條銹菌小種CYR29由1對(duì)顯性基因YrZh16控制， 被定位在染色體2AS上。

目前已報(bào)道的2AS上的抗條銹病基因有Yr17 [11]以及暫命名的QYrtm.pau-2A[12]和QTL 2AS[13]。從系譜上來(lái)說(shuō)，Yr17存在于載體品種VPM1、Hyak和Madsen中，QYrtm.pau-2A存在于載體品種T.monococcum PAU14087/Kris，QTL 2AS存在于載體品種Kris/Wasmo，而YrZh16存在于中梁16（水源11/山前麥），與前者并無(wú)交集。從染色體位置來(lái)說(shuō)，QYrtm.pau-2A和QTL 2AS靠近染色體端部位置，而YrZh16在染色體短臂中間位置。QYrtm.pau-2A 和QTL 2AS雖然定位在2AS染色體上，但是這兩個(gè)基因均為成株期抗條銹病基因，只在成株期表達(dá)，而YrZh16為苗期抗病基因（又稱全生育期抗病基因）不同。用Yr17單基因系苗期接種CYR29 的抗病性表現(xiàn)為中抗（IT 2），而中梁16接種CYR29的抗病性表現(xiàn)為近免疫。此外用CYR29接種山前麥結(jié)果表現(xiàn)高感，而水源11表現(xiàn)高抗，說(shuō)明YrZh16可能來(lái)源于水源11。綜合以上分析，YrZh16可能是一個(gè)與已知基因不同的新基因。

1990年中國(guó)小麥條銹病大流行，給中國(guó)小麥產(chǎn)量造成嚴(yán)重?fù)p失，有些地區(qū)小麥減產(chǎn)高達(dá)50%，有的甚至顆粒無(wú)收。這次條銹病大流行是由于CYR29號(hào)生理小種迅速發(fā)展（1989年其頻率達(dá)40.3%）而導(dǎo)致大面積的種植含有抗條銹基因Yr9的“洛類(lèi)”及其衍生系品種喪失抗條銹性[14]。目前，中國(guó)小麥生產(chǎn)上的主流品種仍然以“洛類(lèi)”衍生系、繁6衍生系和揚(yáng)麥系為主，它們中的大多數(shù)均感條銹病。由于小種專(zhuān)化抗病基因容易被新的條銹菌小種克服，在抗病育種過(guò)程中，中梁16需要與成株抗病基因以及其他全生育期抗病基因等基因聚合，以提高品種的抗病使用年限。在本研究中所明確的抗條銹病基因和獲得的分子標(biāo)記，對(duì)分子標(biāo)記輔助育種和改良抗條銹品種具有重要意義。

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（責(zé)任編輯 羅亞軍）

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（責(zé)任編輯 羅亞軍）

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（責(zé)任編輯 羅亞軍）