殷得所　李進波　夏明元　等

摘要：采用田間自然誘發(fā)鑒定法，對持久抗病品種魔王谷和感病品種鄂晚8號的DH系和F2∶3家系進行了抗性遺傳分析和基因初步定位，并使用NBS-LRR同源序列引物進行了抗性基因的篩選，揭示魔王谷的抗病機理。結(jié)果表明，兩個群體的穗瘟田間抗性由第12染色體RM512標記下游的一對隱性主效基因控制，并在Chr11的RM224下游、Chr7的RM248下游等染色體區(qū)間存在多個QTLs。NBS-LRR基因序列的篩查也表明在Chr12、Chr8、Chr6、Chr11對應區(qū)間的基因與抗性相關度較高。

關鍵詞：稻瘟?。怀志每剐?；基因定位；NBS-LRR同源序列

中圖分類號：Q37；Q341 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）22-5346-05

由子囊菌引發(fā)的水稻稻瘟病是水稻生產(chǎn)中最嚴重的病害。據(jù)統(tǒng)計，全球每年由稻瘟病造成的稻米產(chǎn)量損失足以養(yǎng)活6 000萬人以上，我國稻瘟病年發(fā)病面積約3.8×106 hm2，發(fā)病面積占水稻種植面積的6%，年損失稻谷約1×109 kg，稻瘟病已成為水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的嚴重障礙[1，2]。稻瘟病的防治主要采用化學防治和抗病新品種培育兩種途徑，化學防治成本高、效果差且污染環(huán)境，選育和推廣抗病水稻品種被認為是控制稻瘟病害最安全、經(jīng)濟和環(huán)保的方法。

截至2013年8月，至少報道了68個抗稻瘟病位點的83個主效抗性基因[3]。報道和鑒定了較多持久抗瘟性水稻品種，如Moroberekan、Tetep、OS6、Dourode Perecose、IR36、IR42、IR64以及小粒野生稻、密陽30、湘資3150、天津野生稻、魔王谷、谷梅2號等[4-7]。品種范圍涉及古老的地方品種、栽培稻品種和野生稻。這些抗源品種在稻瘟病的抗病育種中發(fā)揮著重要作用。由于稻瘟病菌容易出現(xiàn)新的生理小種，使得小種?；剐詥适?，多數(shù)抗病品種在推廣種植3～5年后會出現(xiàn)感病，逐漸喪失抗病性[8，9]。因此，延長水稻品種的稻瘟病抗性周期成為當前水稻抗性育種的主要任務，而開展廣譜、持久抗性的水稻育種是解決稻瘟病危害最有效且最環(huán)保的途徑。

魔王谷的持久稻瘟病抗性前人已有報道，本研究采用田間自然發(fā)病的方式，鑒定家系材料的抗病表型，通過構(gòu)建抗病品種魔王谷與感病品種鄂晚8號的DH系和F2∶3群體，分析魔王谷的抗性遺傳。SSR標記群分法與NBS-LRR同源基因比較結(jié)合，對抗病基因所在區(qū)間進行了初步定位。本研究旨在探求廣譜、持久抗病的遺傳基礎，為抗病基因的精細定位和克隆以及育種利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

魔王谷為云南稻區(qū)的地方品種，高抗稻瘟病，本試驗中作為抗源；鄂晚8號為湖北省農(nóng)業(yè)科學院育成的優(yōu)質(zhì)晚粳品種，高感稻瘟?。?311為江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所育成的優(yōu)質(zhì)中秈品種，高感稻瘟病。

1.2 群體構(gòu)建

2007年以魔王谷為父本，與鄂晚8號配制雜交組合， F1代植株取花藥進行花藥培養(yǎng)， 得到加倍單倍體（DH系）植株113株， 海南移栽并收獲單株種子。

按照單粒傳原則，收獲“鄂晚8號/魔王谷”組合 F1單株種子，于海南種成F2群體，分單株收獲種子，得到F2∶3家系。2008年春將DH系和F2∶3家系兩個群體在恩施兩河病圃栽種。

2009年夏在武漢以魔王谷為父本，與9311配制F1雜交組合，再以9311為輪回親本，通過2次回交和自交，構(gòu)建BC2F3回交滲入系。2012年將263個BC2F3家系在宜昌遠安病圃種植。

1.3 田間抗性鑒定和遺傳分析

種子4月初播種，5月初移栽大田，每份家系材料栽插20苗，水肥管理同當?shù)厮?，防蟲不防病。分蘗期調(diào)查葉瘟的發(fā)病率、病級，抽穗后調(diào)查穗瘟損失率、穗瘟病級、發(fā)病率等指標。按照葉瘟病級分為1-9級，穗瘟病級按0、1、3、5、7、9級進行統(tǒng)計。將發(fā)病數(shù)據(jù)制成次數(shù)分布表，進行遺傳推斷。

1.4 葉片DNA提取

選取水稻植株葉片組織，采用CTAB法提取水稻基因組DNA。

1.5 引物篩選、設計與合成

采用水稻12條染色體上460對SSR引物進行抗、感親本間差異標記的篩選，獲得的差異標記進行連鎖標記分析?？共⊥椿蛞镄蛄袇⒖糞hang等[10]發(fā)表的36對Psudogene引物進行序列設計。所有引物由上海生物工程公司合成。

1.6 基因定位

基因分型以魔王谷作為抗病對照，鄂晚8號作為感病對照。采用群分法（Bulked segregant analysis， BSA），用SSR引物進行主效抗性基因的初步篩選，選取DH家系中高抗（穗瘟抗級為0級）和高感（穗瘟抗級為9級）的家系各9個，分別組成抗、感小群體。利用在魔王谷與鄂晚8號間的多態(tài)性SSR引物進行連鎖標記篩選。

利用從9311和日本晴全基因組序列注釋得到的NBS-LRR同源序列，選取在秈稻基因組中有功能而在粳稻基因組中功能缺失的36個NBS-LRR基因，作為感病共分離標記，進行候選基因分析。

按照引物的相關指標進行SSR引物和Psudogene基因引物的PCR擴增，酶切按照酶的使用說明進行。產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠和6%的聚丙烯酰胺凝膠分離，EB和銀染色后照相，統(tǒng)計帶型。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間抗性鑒定與遺傳分析

兩個組合共3個群體，于2008和2012年分別在恩施和宜昌兩地的病圃進行了抗性鑒定?！岸跬?號/魔王谷”組合的F2∶3家系群體共239個，在恩施病圃進行鑒定。葉瘟發(fā)病表現(xiàn)為正態(tài)分布，穗瘟發(fā)病則在0級（高抗）和7級（高感）處各有一個高峰，表現(xiàn)為雙峰分布（圖1），抗感比例為64∶161，經(jīng)卡方驗證符合1∶3（X2=1.245

DH家系共107個，葉瘟發(fā)病表現(xiàn)為正態(tài)分布，穗瘟發(fā)病分布圖在7級處為分界點（圖2），按1對隱性基因推斷假設進行卡方驗證，抗感比例為44：63，X2=3.03

在宜昌病圃進行鑒定的“9311/魔王谷”組合后代BC2F3家系，葉瘟發(fā)病仍然表現(xiàn)為正態(tài)分布，穗瘟發(fā)病則表現(xiàn)為偏態(tài)分布，且抗性家系明顯偏少（圖3），結(jié)合前2個群體的發(fā)病分布推斷，其穗瘟主效抗性基因為隱性控制模式。

2.2 多態(tài)性標記篩選和基因定位

采用群分法（BSA），用84對多態(tài)性SSR引物對DH家系的抗感小群體進行連鎖標記篩查，發(fā)現(xiàn)在第11染色體的RM224和第12染色體的RM512兩個片段區(qū)間的感病基因型和表型符合度高。用這兩個區(qū)間的引物對所有的感病DH家系進行驗證（圖4，圖5），發(fā)現(xiàn)在51個感病家系中，RM224區(qū)間有16個重組體，RM512區(qū)間有6個重組體，RM512位點可以解釋88%的感病表型，因此，將隱性抗病基因初步定位在第12染色體的RM512區(qū)段下游，距離為11.7 cM。

2.3 抗病基因同源序列分析

36對Psudogene引物先進行抗病和感病親本間的差異篩查，所有引物均能擴增出目標產(chǎn)物，但經(jīng)過相應的內(nèi)切酶酶解后，只有Psu12、Psu18、Psu19、Psu21、Psu26、Psu28、Psu35、Psu36這8對引物分別在9311與日本晴和魔王谷與鄂晚8號間有差異（圖6）。用這些引物對全體DH家系進行基因分型，統(tǒng)計基因型與表型的符合度（表2），結(jié)果顯示，位于12號染色體的Psu36抗病同源序列標記符合度最高（圖7），這與SSR分型定位的染色體相同。

3 小結(jié)與討論

3.1 關于田間自然誘發(fā)與抗病表型鑒定

梁斌等[11]用云南省菌株96-5-1a對魔王谷與麗江新團黑谷的F2和BC1F1群體的人工接種鑒定認為，魔王谷抗性由1對顯性基因控制。Sun等[12]用魔王谷與CO39的F2和F8群體進行了遺傳分析，采用318-2菌株進行人工接種和大田誘發(fā)鑒定，表明魔王谷抗性由1對顯性基因控制。本研究根據(jù)3個群體的田間發(fā)病表現(xiàn)分析得出，魔王谷抗性主效基因為隱性基因，與前人研究結(jié)論差異較大，是否與鑒定菌系有關尚不能確定。本研究曾將相同的DH家系同時在恩施和宜昌病圃進行大田自然誘發(fā)鑒定，抗感表型差異很大（實驗室數(shù)據(jù)，未發(fā)表），本試驗對宜昌種植的“9311/魔王谷”的BC2F3群體進行了田間抗性鑒定，結(jié)果顯示與恩施病圃的發(fā)病分布不同。說明恩施和宜昌兩地的菌株致病能力和毒性可能存在差異，從而導致群體的抗感表現(xiàn)不同。

1998年，Pan等[13]報道了一份來自云南當?shù)氐母呖沟疚敛∑贩N“Maowanggu”，其抗性由位于第2和第6染色體的2對顯性基因控制，但對此地方品種的具體來源編號不清楚，無法與本研究中的魔王谷進行比較。

3.2 關于基因定位群體

本研究使用了“鄂晚8號/魔王谷”這個組合的兩個群體的DH家系和F2∶3家系進行表型鑒定和遺傳分析，但主要采用DH家系作為基因定位群體，雖然F2∶3家系數(shù)量較多，定位群體較大，有利于精確定位，但DH家系內(nèi)遺傳背景一致，有利于提高抗性鑒定和標記分析的準確度。另外，本研究使用感病群體作為定位群體，主要為了避免大田誘發(fā)致病環(huán)境中由于熟期等因素導致抗病株的假陽性。

3.3 NBS-LRR抗病同源序列與抗性的關系

水稻秈、粳兩個亞種完成全基因組測序后，抗病基因的保守序列研究有了很大進展。Shang等[10]根據(jù)秈、粳兩亞種對稻瘟病抗性的不同機理，比較了9311和日本晴全基因組內(nèi)NBS-LRR序列的分化，發(fā)現(xiàn)在兩份品種的基因組內(nèi)均存在很多因提前終止或移碼突變導致成為假基因的讀碼框，并且兩個基因組間假基因的組成和分布也存在很大差異，推測一個NBS-LRR功能基因在秈稻中若為抗病基因，則其粳稻中對應的假基因即為感病基因，這個假基因就可以當做感病表型的共分離標記進行群體分析。用這個策略鑒定了秈稻品種、地谷中的Pid3抗稻瘟病基因。本研究借鑒此策略鑒定魔王谷的抗病基因。

3.4 基因定位與克隆

Sun等[12]將魔王谷的顯性抗病基因Pi49定位在第11染色體的兩個SSR標記K10和K134間，遺傳距離分別為1.01和1.89 cM，并檢測到9個QTLs分布在第2、3、6、8、9、12染色體上。本研究也在第11染色體的RM224下游檢測到了貢獻率較大的抗病位點，可能與Pi49區(qū)間相同。本研究采用圖位克隆和NBS-LRR同源基因鑒定法，對魔王谷的抗病相關基因進行了初步定位。群分法（BSA）的結(jié)果顯示，魔王谷的田間抗性除了主效基因外，可能還有其他微效基因參與控制，SSR標記分析和NBS-LRR基因篩選也說明在第6、8、11染色體上存在與家系表型相關度較高的標記位點。本研究獲得的連鎖標記離目標基因尚有一定距離，以假基因作為共分離標記的試驗尚未觀察到與感病表型完全共分離的現(xiàn)象，RM512下游11.7cM的物理位置，大約在8614 402 bp處，與P36的物理位點（18342 097）距離也較遠。推測其原因，除了定位群體對于研究由多基因控制的抗性而言偏小外，還可能是由于感病家系未發(fā)病，導致表型鑒定存在誤差；其次，多基因控制的抗性體現(xiàn)出一定的復雜性，例如，有些家系丟失了主效抗性基因，但由于微效基因的聚合而同樣產(chǎn)生了抗性，導致表型鑒定的誤差。因此，主效基因的精細定位乃至克隆還要依賴于定位群體的擴大和染色體區(qū)間標記的加密來進行深入研究，或者通過回交和標記選擇將主效基因從復雜的多基因背景中剝離出來。另外，分離到病圃中的主要致病菌進行單孢菌系人工接種，可以得到重復性更好的表型鑒定，也可能是可行的方法。

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（責任編輯 韓 雪）

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（責任編輯 韓 雪）