趙真真， 韓瑩琰， 范雙喜*， 李 婷， 王振雨， 劉秀萍

(1．北京農(nóng)學(xué)院，北京昌平102206；2．北京市優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)銷服務(wù)站，北京朝陽 100101)

葉用萵苣熱激蛋白LsHsp70-3701和LsHsp70-1707基因與抽薹特性的表達(dá)分析

趙真真1， 韓瑩琰1， 范雙喜1*， 李 婷1， 王振雨2， 劉秀萍2

(1．北京農(nóng)學(xué)院，北京昌平102206；2．北京市優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)銷服務(wù)站，北京朝陽 100101)

[目的] 探討葉用萵苣熱激蛋白LsHsp70-3701和LsHsp70-1707基因在抽薹前后的表達(dá)水平，分析Hsp70基因與葉用萵苣抽薹的相關(guān)性。[方法]采用實(shí)時(shí)熒光定量方法檢測LsHsp70-3701和LsHsp70-1707基因在不同品種中的相對表達(dá)量，分析其差異性。[結(jié)果]LsHsp70-3701基因在熱敏品種P-S11抽薹期的表達(dá)量顯著高于抽薹前；在耐熱品種G-S59抽薹初期的表達(dá)量與抽薹前無顯著差異，但后期表達(dá)量顯著降低。LsHsp70-1707基因在熱敏品種P-S11抽薹初期表達(dá)量與抽薹前差異不顯著，但其后表達(dá)水平顯著高于抽薹前；在G-S59中抽薹期的最大表達(dá)量低于抽薹前的最大表達(dá)量，但兩者差異不顯著，而其他時(shí)間的相對表達(dá)量卻顯著低于抽薹前最高水平。[結(jié)論]LsHsp70-3701和LsHsp70-1707基因與葉用萵苣抽薹具有一定的相關(guān)性，葉用萵苣抽薹是差異基因表達(dá)的結(jié)果。

葉用萵苣；Hsp70；抽薹；表達(dá)分析

葉用萵苣喜冷涼氣候，夏季高溫易出現(xiàn)“先期抽薹”現(xiàn)象，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降。培育耐熱耐抽薹品種是解決“先期抽薹”問題的重要途徑。抽薹是植物體由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)為生殖生長的過渡期，受眾多基因調(diào)控，目前已知的基因有180多個(gè)[1]，在多個(gè)基因的協(xié)同下植株完成花芽分化、花器官發(fā)生等過程[2-3]。植物抽薹過程中體內(nèi)相關(guān)的組織會(huì)發(fā)生一系列的生理生化變化[4]，尤其是蛋白質(zhì)組分，蛋白質(zhì)是不同基因在不同時(shí)期表達(dá)的產(chǎn)物，在植物體一切生命活動(dòng)過程中起重要作用，與植物的發(fā)育密切相關(guān)[5-6]，研究表明植物在花芽分化和抽薹前，葉片中積累了足夠的可溶性蛋白等物質(zhì)供植物抽薹時(shí)利用[7]。Hsp70是植物熱激蛋白家族中重要的抗逆因子，其作為分子伴侶在蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊[8]、維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、抵抗細(xì)胞凋亡[9]等方面發(fā)揮重要的作用。熱激蛋白Hsp70基因與耐熱性的關(guān)系在小麥[10]、擬南芥[11]、菠菜[12]等植物中已有報(bào)道，而抽薹天數(shù)在一定程度上能夠較好地評價(jià)葉用萵苣種質(zhì)資源的耐熱性[13]，且Hsp70基因與葉用萵苣的耐熱相關(guān)性已得到驗(yàn)證[14]。目前對抽薹機(jī)理研究主要集中在大白菜[15]、甜菜[16]等植物上，而關(guān)于抽薹性與Hsp70的相關(guān)性研究尚未見報(bào)道。筆者研究Hsp70基因在葉用萵苣抽薹前后的變化，推測其在抽薹過程中發(fā)揮的作用，為葉用抽薹機(jī)理的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料供試材料為2個(gè)具有典型抽薹特性的葉用萵苣品種，即熱敏品種P-S11和耐熱品種G-S59，且在正常栽培管理下P-S11品種的抽薹期比G-S59提早20～30 d。2014年8月在北京金六環(huán)農(nóng)業(yè)園播種，待幼苗長至5～6葉大小時(shí)，將長勢相近的幼苗移到人工氣候培養(yǎng)箱中，生長條件為溫度25 ℃，光照強(qiáng)度12 000 lx，光照時(shí)間12 h/d，20 ℃暗期12 h。取抽薹前后各6 d的葉片，液氮速凍，-80 ℃下保存?zhèn)溆谩Ｈ訒r(shí)間為8:30～9:00。

葉用萵苣熱激蛋白LsHsp70-3701(登錄號：KP055787)和LsHsp70-1707(登錄號：KP258179)基因?yàn)楣P者前期克隆的已知基因。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成。使用RNApure Total RNA Kit RNApure 高純總RNA快速提取試劑盒(艾德萊生物公司)提取葉用萵苣葉片總RNA。

取新鮮的植物葉片50～100 mg加1 ml Trizol研磨至勻漿狀，轉(zhuǎn)移至離心管中，靜置5～10 min；加500 μl氯仿，渦旋振蕩5 min，室溫靜置3 min；4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min；取上清至新的離心管，加700 μl氯仿，混勻，靜置3 min；吸上清至新的離心管，加1/2倍無水乙醇，混勻；將全部溶液和混合物吸入吸附柱中，靜置2 min，12 000 r/min離心3 min，棄廢液；500 μl去蛋白液RE，12 000 r/min離心45 s，棄廢液，重復(fù)一次；500 μl漂洗液RW，12 000 r/min離心45 s，棄廢液，重復(fù)一次；將吸附柱放回空收集管中，12 000 r/min離心3 min，盡量除去漂洗液；吸附柱放入RNAase free 離心管中，在吸附膜中間部位加入30 μl RNAase free water，室溫靜置5 min，12 000 r/min離心2 min。

以提取的總RNA為模板，Oligo d(T)18為引物，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、脫氧核糖核酸dNTP(10 mM)、RNase抑制劑(均購于TaKaRa公司)等作用合成cDNA第一鏈。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR。按照SYBR?PremixExTaqTM Ⅱ(購自TaKaRa)說明書，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)方法對基因的表達(dá)性差異進(jìn)行分析。以葉用萵苣18S ribosomal RNA(序列號：HM047292.1)為內(nèi)參基因，實(shí)時(shí)熒光定量所用引物序列見表1。

將反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA分別進(jìn)行5倍梯度稀釋(1、1/10、1/100、1/1 000、1/10 000)，并進(jìn)行熒光定量反應(yīng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性20 s，59 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s(40個(gè)循環(huán))；最后65～95 ℃，每上升0.5 ℃保溫30 s，檢測其熒光值，繪制溶解曲線。內(nèi)參基因反應(yīng)程序與目標(biāo)基因的反應(yīng)程序相同，標(biāo)準(zhǔn)品cDNA和待測樣品均設(shè)置3次重復(fù)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量所用引物序列

對2個(gè)品種抽薹前后的葉片組織進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析。以抽薹前第6天的葉片表達(dá)量為1，采用2-△△Ct法[17]計(jì)算并作圖。采用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LsHsp70-3701基因在抽薹前后的表達(dá)分析熱敏品種P-S11中，LsHsp70-3701基因在抽薹前表達(dá)水平保持穩(wěn)定，而抽薹第1天表達(dá)量上升，相對表達(dá)量為3.68，抽薹第2天達(dá)到最大7.72，且抽薹前后基因的表達(dá)量差異極顯著(P<0.01)，抽薹后表達(dá)量呈先上升后下降再上升再下降的趨勢，但其表達(dá)水平與抽薹前的相對表達(dá)量有極顯著差異(P<0.01)(圖1A)。

耐熱品種G-S59中，LsHsp70-3701基因整體表達(dá)水平穩(wěn)定，抽薹第1天與抽薹前的表達(dá)量差異不顯著，抽薹第2天相對表達(dá)量降低至0.42，與抽薹前的表達(dá)量差異極顯著(P<0.01)，后呈先上升后下降趨勢(圖1B)。

2.2 LsHsp70-1707基因在抽薹前后的表達(dá)分析P-S11中，LsHsp70-1707基因在抽薹前表達(dá)水平較穩(wěn)定，抽薹后第1天的表達(dá)量與抽薹前差異不顯著，但第2天表達(dá)水平顯著升高達(dá)到2.12，與抽薹前基因表達(dá)差異極顯著(P<0.01)，之后表達(dá)水平緩慢下降，但與抽薹前差異并不顯著(圖2A)。

G-S59中，LsHsp70-1707基因在抽薹前有一個(gè)先上升后下降的趨勢，抽薹前1 d基因表達(dá)水平較低，抽薹后第1天表達(dá)水平顯著高于抽薹前1～4 d，但顯著低于抽薹前第5天，之后表達(dá)量呈先下降后上升又下降的趨勢，但均低于抽薹前最高水平，抽薹后第4天相對表達(dá)量達(dá)到最高，但與抽薹前第5天差異不顯著(圖2B)。

3 結(jié)論與討論

劉磊等[18]在洋蔥抽薹研究中發(fā)現(xiàn)，未抽薹植株游離氨基酸與可溶性蛋白質(zhì)含量較高，推測洋蔥發(fā)育過程中，蛋白質(zhì)的代謝變化可能是決定其發(fā)育進(jìn)程的內(nèi)在原因；劉莎莎等[19]在菠菜抽薹特性研究中發(fā)現(xiàn)，抽薹期可溶性蛋白含量出現(xiàn)高峰，該研究中，LsHsp70-3701基因在P-S11中抽薹后的相對表達(dá)量顯著高于抽薹前。在G-S59中，抽薹初期LsHsp70-3701的表達(dá)量與抽薹前無明顯差異，且后期顯著低于抽薹前，可能是由于抽薹早期較高的蛋白質(zhì)含量對抽薹發(fā)生有利，抽薹后則可溶性蛋白含量降低，這與邱黛玉等[20]在當(dāng)歸抽薹性研究中的結(jié)果一致。

研究表明，當(dāng)歸在抽薹前期抽薹植株的可溶性蛋白含量比未抽薹植株高，而在抽薹臨界點(diǎn)時(shí)抽薹植株的可溶性蛋白量卻比未抽薹植株低[21]，這與LsHsp70-1707基因在P-S11中的表達(dá)情況一致，即在抽薹后第1天表達(dá)量低于抽薹前，而抽薹初期顯著高于抽薹前。該研究中，LsHsp70-1707基因在G-S59中抽薹后的最高水平低于抽薹前最高水平，但兩者差異不顯著，抽薹后其他時(shí)間的相對表達(dá)量卻顯著低于抽薹前最高水平，這與當(dāng)歸植物可溶性蛋白的大量積累有利于抽薹開花，而在抽薹期因消耗大量營養(yǎng)物質(zhì)而比未抽薹植株低的結(jié)果類似[21]。

甜菜抽薹過程中，蛋白質(zhì)含量和氨基酸總量均增加，Glu、Gly、Ala、Met、Asp、Ser、Thr、Lys、Lue 等氨基酸組分抽薹前至抽薹時(shí)先升高，抽薹后又迅速下降，推測抽薹可能與這些氨基酸的變化有關(guān)，且甜菜抽薹可能是差異基因表達(dá)的結(jié)果[16]。LsHsp70-3701氨基酸含量較多的是Gly、Lys、Glu，LsHsp70-1707氨基酸含量較多的是Val、Ala、Gly，且這2個(gè)基因在不同品種葉用萵苣抽薹之后均有一個(gè)表達(dá)量升高后下降的過程，推測這2個(gè)基因與葉用萵苣抽薹具有一定的相關(guān)性，葉用萵苣抽薹可能也是差異基因表達(dá)的結(jié)果。

2個(gè)Hsp70基因在葉用萵苣不同品種抽薹前后的表達(dá)特性不同。在晚抽薹植株中抽薹后表達(dá)量的最高量低于抽薹前最高表達(dá)量，而在P-S11中2個(gè)Hsp70抽薹后的表達(dá)量高于抽薹前，這可能是由于晚抽薹品種能較好地適應(yīng)抽薹過程，而早抽薹品種則需要大量的Hsp70蛋白質(zhì)參與抽薹過程，為生殖生長做好充足的物質(zhì)準(zhǔn)備。通過檢測LsHsp70-3701基因和LsHsp70-1707基因在不同抽薹特性的葉用萵苣品種中的表達(dá)水平，研究了Hsp70基因與葉用萵苣抽薹的相關(guān)性，為研究葉用萵苣抽薹機(jī)理提供了分子基礎(chǔ)，為耐熱耐抽薹特性的研究提供了新的思路

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Expression Analysis of Heat-shock-proteinLsHsp70-3701 andLsHsp70-1707 Gene from Leaf Lettuce (LactucasativaL.) in Bolting

ZHAO Zhen-zhen,HAN Ying-yan,FAN Shuang-xi*et al

(Beijing University of Agriculture,Changping,Beijing 102206)

[Objective] The research preliminarily studied the expression of heat-shock-proteinLsHsp70-3701 andLsHsp70-1707 and analyzed the correlation between Hsp70 gene and bolting of leaf lettuce.[Method] Real-time quantitative PCR (qRT-PCR) was used to analyze theLsHsp70-3701 andLsHsp70-1707 expression differences in different varieties ofLactucasativa.[Result] TheLsHsp70-3701 gene expression level in bolting were significantly higher than that before bolting in P-S11.The expression of the early bolting was no significant difference with the former boltingthe expression and significantly decreased in the late in G-S59.The difference ofLsHsp70-1707 gene expression inearly bolting and before bolting was not significant,but then expression levels were significantly higher than before bolting.The maximum expression of bolting lower than the maximum expression of before bolting and the difference was not significant in G-S59,but the expression of the other time was significantly lower than the highest level of before bolting.[Conclusion]LsHsp70-3701 andLsHsp70-1707 have some relevance with bolting of leaf lettuce,and bolting is the result of differences in gene expression.

LactucasativaL.; Hsp70; Bolting; Expression analysis

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“葉用萵苣高溫抽薹相關(guān)蛋白的鑒定及其互作分析”(31372057)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“葉用萵苣高溫脅迫響應(yīng)因子LsHsp70的功能研究”(31401883)；北京市葉類蔬菜創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)專項(xiàng)(blvt-02)；北京市農(nóng)業(yè)科技項(xiàng)目“生菜耐熱新品種繁育及安全生產(chǎn)技術(shù)試驗(yàn)示范”(20140134)；北京市科技成果轉(zhuǎn)化提升計(jì)劃項(xiàng)目“高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)生菜產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)示范與成果轉(zhuǎn)化”(PXM2015_014207_000012)。

趙真真(1990-)，女，山東青島人，碩士研究生，研究方向：葉用萵苣熱激蛋白。*通訊作者，教授，博士，從事葉用萵苣生理和分子方向研究。

2015-04-09

S 188

A

0517-6611(2015)14-027-03