陳伯叢，梁曉燕，羅德祥

(廣東省佛山市中醫(yī)院藥劑科，廣東 佛山 528000)

原位凝膠是指高分子聚合物的溶液因溫度、離子強(qiáng)度或pH的改變而在用藥部位發(fā)生相轉(zhuǎn)變，形成的半固體制劑。這種對外界物理或化學(xué)條件的微小變化發(fā)生響應(yīng)的性質(zhì)，在藥物控制釋放領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。由于兼具液體與凝膠制劑的優(yōu)點(diǎn)，該藥物傳遞系統(tǒng)已逐步發(fā)展成為環(huán)境敏感凝膠最受矚目的分支。大川芎方主含川芎、天麻，處方來源于《宣明論方》，臨床用于偏頭痛尤其是寒凝血瘀、腦竅不利等癥狀，經(jīng)數(shù)十年臨床驗(yàn)證，療效確切。綜合考慮各藥味的有效成分性質(zhì)及鼻腔給藥的優(yōu)勢，將其開發(fā)研究成以去乙酰結(jié)冷膠(deacetylated gellan gum，DGG)為基質(zhì)的鼻腔給藥用的離子敏感即型凝膠。現(xiàn)將其制備方法及毒性初步評價(jià)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Waters 2695 -2996 型高效液相色譜儀;Mettler AE 200 型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。去乙酰結(jié)冷膠(上海眾偉化工有限公司，批號20130801);其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)[1]

色譜柱:Kromasil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈(A) -1%磷酸溶液(B)，按表1 進(jìn)行梯度洗脫;流量:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL。檢測器漂移管溫度為70 ℃，載氣壓力為30 psi(1 psi=6.894 7 kPa)，柱溫為25 ℃，DAD 檢測器的檢測波長270 nm(天麻素)、321 nm(阿魏酸)。在該色譜條件下，天麻素和阿魏酸理論板數(shù)均為6 000，分離度分別為4.1 和8.4，可達(dá)基線分離，其他成分對測定無干擾。

表1 流動相梯度洗脫表

2.2 制劑處方設(shè)計(jì)與優(yōu)選研究

2.2.1 基本處方確定

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，先確定基本處方，在此基礎(chǔ)上以制劑黏度的變化及體外釋藥性能為指標(biāo)進(jìn)行處方篩選。為滿足藥物鼻腔噴霧溶液的等滲性及防腐性，需加入5%甘露醇和0.01%的醋酸洗必泰，基本處方見表2。

2.2.2 滲透壓調(diào)節(jié)劑、防腐劑確定

為了使制劑的滲透壓調(diào)節(jié)在生理范圍內(nèi)，加入5%甘露醇作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，同時(shí)加入0.02%的醋酸洗必泰作為防腐劑。成凝基質(zhì)篩選的重點(diǎn)主要集中在去乙酰結(jié)冷膠的用量上。

表2 基本處方

2.2.3 去乙酰結(jié)冷膠用量篩選

制劑黏度測定:稱取一定量的去乙酰結(jié)冷膠至適當(dāng)容器中，加入適量的去離子水，在磁力攪拌下加熱至100℃使其分散均勻，按 表2 成 分 制 成 含0.1% ，0.2% ，0.3% ，0.4% ，0.5% ，0.8%，1.0%的去乙酰結(jié)冷膠溶液。參照2010 年《中國藥典(二部)》附錄黏度測定第二法，使用旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)，于體溫條件下測定不同去乙酰結(jié)冷膠濃度溶液的動力黏度，繪制濃度-黏度曲線，以此考察適宜的制劑黏度。同時(shí)將0.2%，0.4%，0.8% 3 種濃度的去乙酰結(jié)冷膠制劑與等量體積的人工鼻液反應(yīng)，以相同方法測定制劑反應(yīng)后的黏度，并觀察凝膠形態(tài)。

制劑釋藥性能考察:參考文獻(xiàn)[2]采用改良的Franz 擴(kuò)散池測定大川芎即型凝膠的體外釋放度，將半透膜(截留相對分子質(zhì)量6 000 ～8 000)用502 膠固定在擴(kuò)散池兩池間，擴(kuò)散池兩池內(nèi)徑為1.3 cm，釋藥面積約為1.33 cm2，向給藥池中準(zhǔn)確加入2 mL大川芎即型凝膠，將擴(kuò)散池放入16 mL 的37 ℃人工鼻液中，向接收池中加入已預(yù)熱至37 ℃的人工鼻液10 mL 作為接收液，接收池中置一攪拌子以100 r/min 的轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)動，于15，30，45，60，90，120，180 min 分別取樣，將介質(zhì)全部取出并迅速補(bǔ)加等量預(yù)熱的人工鼻液，樣品液經(jīng)適當(dāng)稀釋，0.45 μm 微孔濾膜過濾，并續(xù)濾液按2.1 項(xiàng)下色譜條件，測定阿魏酸、天麻素的峰面積，計(jì)算累積釋放度。

篩選結(jié)果:去乙酰結(jié)冷膠溶液濃度為0.1% ～0.5%時(shí)，黏度較低，黏度隨去乙酰結(jié)冷膠的濃度的增加而緩慢上升，當(dāng)去乙酰結(jié)冷膠的濃度增加至0.8%甚至1%時(shí)，整個(gè)體系的黏度有突躍現(xiàn)象，達(dá)到5 000 mPa·s。對于3 種去乙酰結(jié)冷膠濃度的制劑，體系粘度均隨剪切速率增大呈明顯下降趨勢，其中0.4%的去乙酰結(jié)冷膠溶液在反應(yīng)前具有一定的黏度，與人工鼻液反應(yīng)后黏度有明顯提高。同時(shí)經(jīng)目測觀察發(fā)現(xiàn)，0.4%去乙酰結(jié)冷膠溶液也可形成粘稠狀的凝膠，0.2%和0.8%的去乙酰結(jié)冷膠溶液雖然也具有遇人工鼻液膠凝的特性，但前者欠缺反應(yīng)前后黏度的突躍特性，后者反應(yīng)前后黏度變化不大，始終停滯于較高水平。0.4%的去乙酰結(jié)冷膠制劑形成均一、柔軟的凝膠，累積釋放量也呈緩慢上升之勢，其在起初的時(shí)間里藥物釋放較快，但無明顯突釋現(xiàn)象，分析原因可能是聚合物膠凝的滯后時(shí)間導(dǎo)致制劑在進(jìn)入體內(nèi)到形成凝膠這段時(shí)間內(nèi)存在藥物的快速釋放。在發(fā)生凝膠反應(yīng)的過程中，聚合物仍以液體形式存在，藥物很快從溶液中擴(kuò)散出去從而導(dǎo)致藥物釋放。因此，最理想的去乙酰結(jié)冷膠的用量應(yīng)控制在0. 4%。

2.2.4 最終處方

稱取處方量醋酸洗必泰至適當(dāng)容器中，加入適量的去離子水?dāng)嚢枋怪芙?，然后加入處方量去乙酰結(jié)冷膠，在磁力攪拌下加熱至100 ℃使其分散均勻，然后置4 ℃冰箱中完全冷卻，得到澄明溶液，最后加入甘露醇及大川芎提取物攪拌使其溶解，用去離子水定容至總量，分裝于噴霧瓶中，裝上鼻腔噴霧劑泵，即得。大川芎即型凝膠的最終處方見表3。

表3 最終處方(g)

2.3 毒性評價(jià)

2.3.1 局部刺激性試驗(yàn)

取SD 大鼠30 只，隨機(jī)分成3 組，每組10 只。設(shè)置大川芎即型凝膠給藥組、空白對照組(給予生理鹽水)、賦形劑組(空白即型凝膠基質(zhì))。每天給藥1 次，連續(xù)7 d，在最后一次給藥后24 h 處死大鼠，取出局部鼻腔黏膜，觀察有無充血、紅腫等現(xiàn)象，如有變化則進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。結(jié)果顯示，連續(xù)7 d 給藥后，大川芎即型凝膠組、賦形劑組和空白對照組動物的全身狀況未見明顯改變，也未見哮喘、咳嗽、嘔吐、窒息等局部刺激癥狀。處死后觀察局部黏膜組織，各組均無充血、紅腫、潰破等現(xiàn)象。提示常規(guī)用藥劑量下，該鼻腔噴霧劑不會對用藥者的局部組織產(chǎn)生明顯的刺激作用。

2.3.2 蟾蜍上顎黏膜纖毛運(yùn)動影響試驗(yàn)

選取中華大蟾蜍20 只，隨機(jī)分成4 組，每組5 只，即大川芎即型凝膠給藥組;賦形劑組，即空白即型凝膠基質(zhì);空白對照組，即0.9%氯化鈉注射液;陽性對照組，即去氧膽酸鈉溶液。將蟾蜍仰臥固定，使口腔張開，于上顎黏膜處滴加試驗(yàn)樣品溶液0.5 mL，使浸沒上顎黏膜，持續(xù)接觸4 h 后用生理鹽水洗凈，分離并洗凈上顎黏膜，將黏膜面向上平鋪于載玻片上，滴加生理鹽水，蓋上蓋玻片，于44 ×10 倍光學(xué)顯微鏡下觀察纖毛的運(yùn)動情況。觀察完畢，將載玻片擱置加有少量蒸餾水的層析缸中，密閉，20 ～25 ℃條件使缸內(nèi)水蒸氣近飽和。每隔一段時(shí)間取出標(biāo)本觀察，記錄從洗凈試驗(yàn)樣品至纖毛運(yùn)動停止的時(shí)間。以生理鹽水為陰性對照組，用試驗(yàn)樣品的纖毛持續(xù)運(yùn)動時(shí)間除以對照組的時(shí)間得纖毛持續(xù)運(yùn)動相對百分率，百分率越高，表示試驗(yàn)樣品對纖毛的毒性影響越小。

結(jié)果顯示，給予生理鹽水的陰性對照組，光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，蟾蜍上顎黏膜面完整，無纖毛脫落現(xiàn)象，纖毛運(yùn)動非?；钴S，纖毛持續(xù)運(yùn)動時(shí)間平均為(970 ±45)min。給予鼻腔噴霧劑基質(zhì)后，光學(xué)顯微鏡觀察顯示，黏膜面完整，纖毛數(shù)量多，運(yùn)動活躍，與生理鹽水對照組相比無顯著差異。給予大川芎即型凝膠后，光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)黏膜表面部分纖毛運(yùn)動略有減弱，纖毛持續(xù)運(yùn)動時(shí)間百分率也略低于陰性對照組，表明大川芎即型凝膠對纖毛運(yùn)動有一定的影響，但并不嚴(yán)重，可以用于臨床。給予去氧膽酸鈉后，黏膜表面雜亂，纖毛完全脫落，說明其對黏膜組織及纖毛運(yùn)動有嚴(yán)重影響。

3 討論

大川芎鼻用即型凝膠劑以去乙酰結(jié)冷膠為凝膠基質(zhì)，以溶液噴霧的形式給藥，與鼻腔黏膜接觸后因環(huán)境離子強(qiáng)度的變化而發(fā)生相轉(zhuǎn)變，形成凝膠。在制備的過程中，由于醋酸洗必泰較難溶于水，因此先加入大量的水?dāng)嚢璨⑷芙?，然后按順序加其他成分制備大川芎即型凝膠。

多糖衍生物去乙酰結(jié)冷膠的水溶液具有陽離子誘導(dǎo)凝膠的性質(zhì)，即在常規(guī)條件下是自由流動的液體而在某些生理?xiàng)l件下可形成澄明的凝膠。有研究表明，去乙酰結(jié)冷膠為陰離子型線性多糖，具有平行的雙螺旋結(jié)構(gòu)，溶液中的一價(jià)或二價(jià)陽離子與聚合物鏈上的羰基絡(luò)合，參與形成穩(wěn)定雙螺旋的鏈間氫鍵，每2 條雙螺旋逆向聚集，構(gòu)成三維凝膠網(wǎng)絡(luò)[2]，利用這一獨(dú)特性質(zhì)可設(shè)計(jì)鼻用、眼用制劑以及植入給藥系統(tǒng)。因此，本研究中基于此性質(zhì)制備了大川芎提取物鼻腔給藥用即型凝膠。

[1] 徐艷麗，劉天富，王中彥，等. HPLC 測定注射用大川芎(凍干)中阿魏酸和天麻素的含量[J]. 中成藥，2006，28(9)：1 281 -1 284.

[2] 曹師磊. 離子敏感即型凝膠劑在鼻腔給藥系統(tǒng)中的應(yīng)用[D]. 上海：復(fù)旦大學(xué)，2007.