吳軍林，吳清平，張菊梅，張 文

（1.廣東省微生物研究所，廣東省華南應(yīng)用微生物重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地；廣東省微生物菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室，廣東省微生物新技術(shù)公共實驗室，廣東廣州510070；2.廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，廣東廣州510643）

結(jié)冷膠（gellan gum）是由原稱為伊樂假單胞菌（Pseudomonas elodea ATCC 31461），后來基于r-RNA特征及含有鞘氨醇糖脂被進一步確認(rèn)為少動鞘脂單胞菌（Sphingomonas paucimobilis），又譯名少動鞘氨醇單胞菌，經(jīng)過有氧發(fā)酵所產(chǎn)生的細(xì)胞外多糖（extraeellular polysaeeharide，EPS）[1]。具有食用安全、用量低、耐酸堿性、適宜的風(fēng)味釋放性、高熱穩(wěn)定性等特性，廣泛應(yīng)用于化妝品、食品、化工等多個領(lǐng)域，是近年來最有發(fā)展前景的微生物食用膠。自1978年美國科學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)結(jié)冷膠，直到1982年才出現(xiàn)規(guī)?；l(fā)酵得到結(jié)冷膠的報道。日本最早于1988年成功地完成了結(jié)冷膠的毒理實驗并準(zhǔn)許結(jié)冷膠在食品中應(yīng)用，美國食品與藥物管理局（FDA）于1992年批準(zhǔn)結(jié)冷膠作為穩(wěn)定劑和粘結(jié)劑在食品中使用[2]。我國也在1996年批準(zhǔn)其作為食品增稠劑、穩(wěn)定劑使用，并制定了結(jié)冷膠的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 25535。結(jié)冷膠是一個線性四糖重復(fù)單元的長鏈分子，分子量約為0.5×106u的陰離子型線狀聚合物[3]。結(jié)冷膠的基本結(jié)構(gòu)如圖1所示。圖1中n為聚合物的聚合數(shù)目，主鏈由葡萄糖、鼠李糖和葡萄糖醛酸等單糖以2∶1∶1聚合組成，天然結(jié)冷膠（高乙?；Y(jié)冷膠）和低乙?；Y(jié)冷膠在結(jié)構(gòu)上的不同點在于：高乙酰基在每個以β-1-3鍵連接的葡萄糖分子的C2處被L-甘油酸酯化，C6處被乙酸酯化[4]。目前結(jié)冷膠的生產(chǎn)方法主要由微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，國內(nèi)外眾多學(xué)者對結(jié)冷膠的生產(chǎn)菌種及發(fā)酵工藝條件等方面做了大量研究，其目的是為了提高菌株的生產(chǎn)結(jié)冷膠能力，降低生產(chǎn)成本。結(jié)冷膠生產(chǎn)菌大都是從自然界分離篩選的原始菌株經(jīng)物理、化學(xué)方法誘變得到。由于誘變的不確定性，高產(chǎn)菌株在產(chǎn)結(jié)冷膠的同時，也產(chǎn)生大量的黃色類胡蘿卜素，給發(fā)酵產(chǎn)品的分離、提純帶來困難，嚴(yán)重制約了發(fā)酵法生產(chǎn)結(jié)冷膠的工業(yè)化生產(chǎn)[5]。近年來，生物工程、基因改良技術(shù)突飛猛進，使得結(jié)冷膠合成基因簇的基礎(chǔ)研究較為透徹，結(jié)冷膠基因簇（gel基因簇）中已被識別的結(jié)構(gòu)和序列與已測序的多糖sphingan S-88的合成基因簇（sps基因簇）十分相似，且相對應(yīng)的基因也有很高的同源性，因此，在分子和基因水平研究少動鞘脂單胞菌發(fā)酵產(chǎn)結(jié)冷膠的基因調(diào)控，對提高結(jié)冷膠產(chǎn)量成為可能，本文綜述了國內(nèi)外微生物發(fā)酵法制備結(jié)冷膠方面的研究進展，以期為結(jié)冷膠的研究和開發(fā)提供新思路和方向。

圖1 結(jié)冷膠的分子結(jié)構(gòu)重復(fù)單元Fig.1 Molecular structure of the repeat unit of gellan

1 結(jié)冷膠的生物合成

有關(guān)結(jié)冷膠的合成代謝與調(diào)控一直是代謝領(lǐng)域的研究熱點。目前以少動鞘脂單胞菌為模式生物的結(jié)冷膠生物合成途徑是一個多步驟過程，已經(jīng)闡述清楚，可分為三個連續(xù)的步驟：a.胞內(nèi)糖活化前體的合成；b.四糖重復(fù)單元的合成；c.重復(fù)單元的移位、聚合及結(jié)冷膠分泌到膜外。王霞等[6]對結(jié)冷膠的生物合成機理研究報道的比較清晰。

結(jié)冷膠的生物合成過程起始于核苷酸糖前體物質(zhì)：UDP-D-葡萄糖、UDP-D-葡萄糖醛酸、dTDP-L-鼠李糖。合成途徑中參與的酶有：Sucrosehydrolase（蔗糖水解酶）、Hexokinase（己糖激酶）、Phosphofructokinase（磷酸果糖激酶）、UGP（UDP-葡萄糖焦磷酸化酶）、TGP（TDP-葡萄糖焦磷酸化酶）、UGD（UDP-葡萄糖脫氫酶）、TRS（TDP-鼠李糖合成酶）。在該途徑中，1-磷酸葡萄糖是個關(guān)鍵代謝位點，由它開始代謝途徑分為兩條，一條合成UDP-D-葡萄糖醛酸；而另外一條途徑合成UDP-D-葡萄糖和dTDP-L-鼠李糖。之后，胞內(nèi)合成的核苷酸前體物質(zhì)通過與細(xì)胞壁內(nèi)的脂質(zhì)載體相連接而形成結(jié)冷膠多糖的基本單元。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的一些核糖轉(zhuǎn)移酶將這些多糖片斷由細(xì)胞內(nèi)部轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜。最后，由細(xì)胞膜內(nèi)的GelS蛋白質(zhì)協(xié)助多糖基本單元跨膜運動，再通過GelC、GelE等蛋白質(zhì)，將多糖的基本單元合成為具有一定長度的結(jié)冷膠多糖重復(fù)單元即結(jié)冷膠的低聚物，最后通過蛋白質(zhì)GelC分泌到胞外，形成具有一定聚合度的結(jié)冷膠多糖[6-7]。Gai等[1]繪制了少動鞘脂單胞菌ATCC31461染色體基因組序列草圖，并從中發(fā)現(xiàn)結(jié)冷膠生物合成、調(diào)控、修飾有關(guān)的特征基因，為結(jié)冷膠生物合成調(diào)控及代謝調(diào)控規(guī)律研究奠定了基礎(chǔ)。

2 結(jié)冷膠生產(chǎn)菌種構(gòu)建

2.1 結(jié)冷膠生產(chǎn)菌種的誘變

從生物技術(shù)的角度來看，Sphingomonas這一屬中的菌株的共同特征是能分泌出如結(jié)冷膠、沃侖膠、鼠李膠這樣的一類多糖。這些菌株能從多種環(huán)境中分離得到，不過Sphingomonas paucimobilis中的多數(shù)菌株是從臨床樣本或醫(yī)院周邊環(huán)境中分離到的。結(jié)冷膠的生產(chǎn)菌種可以從土壤、空氣、水樣、動物體組織、植物體中分離獲得。工業(yè)上最早采用的結(jié)冷膠生產(chǎn)菌株為Pseudomonas elodea，它是從一種植物水百合上分離而得的一種好氧的革蘭氏陰性菌，端生鞭毛，后確認(rèn)被為少動鞘氨醇單胞菌（少動鞘脂單胞菌），該菌自1982年首次被發(fā)現(xiàn)以來，已廣泛應(yīng)用于結(jié)冷膠的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)[2]。近年來，結(jié)冷膠的微生物發(fā)酵生產(chǎn)越來越引人關(guān)注。科研工作者們嘗試了通過傳統(tǒng)誘變菌種的方法以提高結(jié)冷膠的產(chǎn)率。

West等分離出了S.paucimobilis ATCC 31461的突變株，其結(jié)冷膠產(chǎn)量較原菌株高約1.4倍，彭志英等利用搖瓶培養(yǎng)分離獲得一株少動鞘脂單胞菌Sl，并優(yōu)化了該菌產(chǎn)胞外多糖的工藝條件，Sl菌胞外多糖的產(chǎn)量最高達8.98g/L，發(fā)酵液粘度最高可達45000mPa·s[8]。王姍杰等[9]采用低能N+離子束注入對出發(fā)菌Pseudomonas elodea ATCC 31461進行離子照射誘變，確定了合適的誘變條件為離子束照射（10keV，注入劑量為200×1014個N+/cm2，200s），以氨芐青霉素作為抗性篩選藥物，經(jīng)過初篩和復(fù)篩得到一株高產(chǎn)結(jié)冷膠突變株P(guān)seudomonas elodea A3-5。突變菌株經(jīng)傳代培養(yǎng)，結(jié)冷膠產(chǎn)量未出現(xiàn)較大的變化，遺傳穩(wěn)定性較好，突變株形態(tài)較出發(fā)菌有較大變化，生長速度加快，結(jié)冷膠產(chǎn)量達16.5g/L，較出發(fā)菌株提高了25%。由此可見，微生物合成結(jié)冷膠以氨芐青霉素為藥物篩選是一種有效的方法，但對氨芐青霉素抗性與結(jié)冷膠產(chǎn)量之間的相關(guān)性機制需要進一步的研究。

2.2 改變結(jié)冷膠合成途徑

基因工程菌的構(gòu)建一直以來成為提高菌株目的產(chǎn)物的有效手段，由于結(jié)冷膠生產(chǎn)過程中糖轉(zhuǎn)化率（40%～50%）較低[5]，通過對結(jié)冷膠代謝途徑的深入了解，Vartak等[10]通過基因工程修飾出發(fā)菌株ATCC 31461以增加其合成效率，期盼獲得較高的糖轉(zhuǎn)化率。研究者們先從S. elodea細(xì)胞內(nèi)克隆編碼葡萄糖-6-磷酸葡萄糖脫氫酶的ZWF基因，部分測序后構(gòu)建了敲除ZWF基因的工程菌，期望細(xì)胞內(nèi)碳代謝流向結(jié)冷膠合成方向，減少在磷酸戊糖途徑中因生成大量的CO2而降低轉(zhuǎn)化率，但這種重組并沒有顯著提高結(jié)冷膠的合成效率。Zhu等[11]克隆并鑒定了少動鞘氨醇單胞菌ATCC 31461的類胡蘿卜素的生物合成途徑中編碼八氫番茄紅素脫氫酶基因crtI，敲除crtI基因?qū)е曼S色類胡蘿卜素色素合成受阻，結(jié)冷膠的產(chǎn)量與野生型基本相同，但結(jié)冷膠回收時所使用的乙醇減少30%，使下游純化成本顯著減少。

2.3 阻斷競爭性分支途徑

Vartak等[10]發(fā)現(xiàn)結(jié)冷膠生產(chǎn)菌的最佳發(fā)酵條件極易出現(xiàn)C/N比失衡的問題，有利于副產(chǎn)物聚β-羥丁酸（PHB）合成，結(jié)冷膠的最佳發(fā)酵條件也是副產(chǎn)物PHB合成的最佳條件，因此，發(fā)酵過程中結(jié)冷膠的合成會與PHB合成競爭碳源。Baird和Cleary通過隨機突變，使出發(fā)菌株P(guān)HB的合成受阻，但沒有提高結(jié)冷膠的合成效率，可能化學(xué)隨機誘變在阻斷PHB合成的同時，還導(dǎo)致了其他不利突變，因此有學(xué)者嘗試通過基因敲除的方法阻斷PHB的合成途徑[12]。Motrison等構(gòu)建了敲除PHB聚合酶基因（phac）的工程菌種，有效阻斷PHB的合成，但此工程菌株產(chǎn)膠能力反而下降[13-14]，可能影響工程菌株的生長，需要進一步的深入研究。

2.4 增加結(jié)冷膠合成途徑中關(guān)鍵酶的表達

隨著在結(jié)冷膠合成的遺傳特性方面取得顯著的發(fā)展。越來越多的基因工程控制策略已應(yīng)用于結(jié)冷膠的早期合成步驟中。Sá-Correia等[15]在S. elodea ATCC 31461中分別過表達pgmG基因（葡糖磷酸變位酶）和ugpG基因（UDP-葡萄糖焦磷酸化酶），提高了特異性酶的活力，使UDP-葡萄糖合成增加，然而對提高結(jié)冷膠的合成并不顯著，而同時過度表達pgmG基因和ugdG基因，使結(jié)冷膠的產(chǎn)量和ESP粘度增長了20%。將基因工程技術(shù)應(yīng)用于結(jié)冷膠的中后期合成步驟中的研究也有報道。Thorne等由Sphingomonas sp. ATCC 21423合成糖活化前體sphingan S-7的基因調(diào)控過程中，同時過度表達S-7基因簇的合成基因，包括特異糖基轉(zhuǎn)移酶、重復(fù)單元聚合以及聚合物分泌等編碼基因，構(gòu)建成的工程菌的多糖sphingan S-7產(chǎn)量同比增長20%，發(fā)酵液的粘度也大大增加[12]。因此對于結(jié)冷膠基因工程改造方面還有許多問題需要解決，結(jié)冷膠合成及其他糖代謝的關(guān)系和調(diào)控，仍然需要深入研究。

2.5 其他位點的基因工程改造

Handing等[16]通過EMS化學(xué)誘變獲得了一株產(chǎn)低酰基結(jié)冷膠的突變株LAM-1，破壞菌株合成乙酰基的途徑，并通過敲除乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因，得到了合成無乙酰基側(cè)鏈的結(jié)冷膠突變株，該工程菌產(chǎn)結(jié)冷膠能力沒有明顯提高，但其合成產(chǎn)物的性質(zhì)發(fā)生了較大的變化。Handing等[17]通過敲除生物合成基因簇中與結(jié)冷膠和細(xì)胞表面結(jié)合相關(guān)的酶GeIN或GeIM后，發(fā)酵液粘度下降，同時也造成出膠率和強度的下降。推測可能原因是上述基因敲除后，結(jié)冷膠更容易受到結(jié)冷膠降解酶Ge1R的降解。因此嘗試在敲除gelN的基礎(chǔ)上，同時敲除結(jié)冷膠降解酶基因gelR，所得的結(jié)冷膠在較低的粘度下具有更高的強度。

高酰基結(jié)冷膠目前主要作為牛奶中的添加劑使用。但是高?；Y(jié)冷膠中會殘留發(fā)酵過程中產(chǎn)生的芳香基硫酸醋酶（arylsulfatase）和β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase），影響牛奶的口味。因此Cleary等[18]敲除了這兩個酶基因，有效解決了牛奶中添加結(jié)冷膠產(chǎn)品影響風(fēng)味的問題。Wu等[5，19]構(gòu)建了含透明顫菌血紅蛋白VHb基因的工程菌，發(fā)現(xiàn)VHb的表達不僅加速了少動鞘氨醇單胞菌的生長，同時也有效地促進了菌株合成結(jié)冷膠的能力，VHb的存在改善了細(xì)胞對氧氣的攝取和利用能力，較有效地緩解了發(fā)酵后期低溶氧條件對菌株細(xì)胞代謝活性的限制。構(gòu)建的工程菌株在6.7L小罐發(fā)酵48h后，結(jié)冷膠產(chǎn)量高達16.82g/L，糖膠轉(zhuǎn)化率達到57.8%，均較原始菌株提高20%。

3 結(jié)冷膠發(fā)酵生產(chǎn)工藝

影響結(jié)冷膠產(chǎn)量的因素有很多，例如培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分、發(fā)酵條件等。國內(nèi)外的研究主要集中在培養(yǎng)基配方和工藝條件方面，有研究表明，較高的C/N有利于多糖的合成[15]。關(guān)于結(jié)冷膠發(fā)酵生產(chǎn)的最佳碳源的研究國內(nèi)外學(xué)者得出的結(jié)果并不一致。Kanari等[20]發(fā)現(xiàn)少動鞘脂單胞菌發(fā)酵產(chǎn)結(jié)冷膠的最適碳源為葡萄糖、蔗糖以及可溶性淀粉。Ashtaputre和Shah[21]認(rèn)為蔗糖是用于Sphingomonas paucimobilis-GS1發(fā)酵產(chǎn)結(jié)冷膠的最佳碳源。Fialho等[22]研究了葡萄糖、乳糖、干酪乳清對Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461發(fā)酵產(chǎn)結(jié)冷膠的影響，發(fā)現(xiàn)采用葡萄糖作為最佳碳源時結(jié)冷膠產(chǎn)量達到14.59g/L，且利用不同的碳源得到的結(jié)冷膠乙?；潭炔⒉幌嗤?。但是，Bajaj等[23]研究結(jié)果表明2%可溶性淀粉為最佳碳源，其結(jié)冷膠產(chǎn)量可以達到24～28g/L。Banik等[24]研究了利用蔗糖工業(yè)上的廉價副產(chǎn)物糖蜜作為碳源來生產(chǎn)結(jié)冷膠，并獲得了13.8g/L的產(chǎn)量。彭志英等[8]研究發(fā)現(xiàn)一葡萄糖或蔗糖為碳源時，菌體及產(chǎn)膠量最好，同時發(fā)現(xiàn)碳源添加方式為二步加糖法時更有利于結(jié)冷膠發(fā)酵生產(chǎn)。

氮源的種類和濃度對結(jié)冷膠產(chǎn)量和質(zhì)量都會產(chǎn)生顯著的影響。Dreveton等[25]研究發(fā)現(xiàn)有機氮源對菌體的生長和結(jié)冷膠的生物合成明顯優(yōu)于無機氮源。Jin等[26]比較了NH4NO3、蛋白胨、大豆油渣對Sphingomonas paucimobilis NK2000發(fā)酵產(chǎn)結(jié)冷膠的影響，研究發(fā)現(xiàn)在沒有NH4NO3存在下，使用大豆油渣代替昂貴的蛋白胨作為氮源，結(jié)冷膠的產(chǎn)量提高了3倍。Nampoothiri等[8]比較了多種有機氮源和無機氮源對結(jié)冷膠發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)蛋白胨為最佳氮源。胡桂萍等[27]研究發(fā)現(xiàn)少動鞘脂單胞菌發(fā)酵產(chǎn)膠最適氮源為豆餅粉。Bajaj等[23]的研究發(fā)現(xiàn)少動鞘氨醇單胞菌在含尿素、NH4NO3等無機氮源的培養(yǎng)基中，菌體長勢非常好，但是結(jié)冷膠的產(chǎn)量卻不高；而利用酵母膏、干酪素、蛋白胨、大豆粉等有機氮源時，雖然菌體的干重有所下降，但是結(jié)冷膠的產(chǎn)量卻有所提高。

Vanderhoff等[28]利用乙醇加工副產(chǎn)物玉米可溶物（CCS）作為氮源與一定濃度葡萄糖為碳源開發(fā)了一種廉價的培養(yǎng)基，結(jié)冷膠產(chǎn)量達到12.5g/L，葡萄糖利用率達到90%以上，具有一定的應(yīng)用前景。

微生物發(fā)酵過程中，溫度是能夠影響結(jié)冷膠產(chǎn)量的重要因素之一，結(jié)冷膠的發(fā)酵溫度一般控制在30℃左右[29]，也有報道，結(jié)冷膠發(fā)酵的最適溫度為30～31℃，菌體生長的最適溫度為31℃，若溫度下降到28℃或升高到33℃，生產(chǎn)菌在最適的生長溫度下產(chǎn)生的結(jié)冷膠要比在其他的溫度下的產(chǎn)量提高將近50%[13]。通氣量也是一個重要的影響因素，如果能夠不斷的攪拌發(fā)酵液并充分通氣，結(jié)冷膠的終產(chǎn)物濃度也會相應(yīng)的增加。一般通過控制攪拌速度和通氣量來提高發(fā)酵液中氧氣濃度[30-31]，但當(dāng)發(fā)酵液粘度增加到一定程度時，需要采用能夠增加供氧的攪拌系統(tǒng)和結(jié)構(gòu)合適的反應(yīng)器來提高結(jié)冷膠的發(fā)酵水平。Arockiasamy和Banik[32]研究了非離子表面活性劑的添加對結(jié)冷膠發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)表面活性劑增強氧的傳遞，在較高的攪拌條件下結(jié)冷膠的產(chǎn)量達到27.86g/L。因此，發(fā)酵液中溶氧條件直接影響菌株的代謝和生長，發(fā)酵體系中具備較好的溶解氧（DO）值，可以顯著提高菌株的代謝速率和產(chǎn)量。改善發(fā)酵過程中溶氧條件可作為結(jié)冷膠發(fā)酵生產(chǎn)工藝技術(shù)優(yōu)化的方向。

也有學(xué)者對結(jié)冷膠的發(fā)酵動力學(xué)和代謝途徑進行了分析，并采用響應(yīng)面實驗設(shè)計等方法改進工藝，提高產(chǎn)量。Banik等[33]通過20個影響結(jié)冷膠發(fā)酵變量的測試，統(tǒng)計分析出糖蜜，蛋白胨，酪蛋白氨基酸，磷酸氫二鈉，氯化錳對結(jié)冷膠的生產(chǎn)具有顯著影響。Arockiasamy 和Banik[32]研究了結(jié)冷膠發(fā)酵流體力學(xué)，通過發(fā)酵動力學(xué)及胞外多糖流變學(xué)特性分析發(fā)現(xiàn)，曝氣對結(jié)冷膠的大規(guī)模生產(chǎn)至關(guān)重要。徐曉琴等[34]研究了少動鞘脂單胞菌發(fā)酵高產(chǎn)結(jié)冷膠的發(fā)酵過程規(guī)律，建立了結(jié)冷膠發(fā)酵過程中菌體生長、產(chǎn)物積累和基質(zhì)消耗的數(shù)學(xué)模型，較好地反映了結(jié)冷膠發(fā)酵過程中菌體生長、底物消耗和產(chǎn)物合成過程及其動力學(xué)機制。Wang等[35]在建立了動力學(xué)模型的基礎(chǔ)上，使Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461結(jié)冷膠產(chǎn)量達到17.71g/L，糖膠轉(zhuǎn)換率達到57.12%。

4 展望

結(jié)冷膠由于具有的特殊的理化性質(zhì)及優(yōu)越的凝膠性能使其具有廣泛的應(yīng)用前景和較高的商業(yè)價值。但受其成本的限制，結(jié)冷膠的應(yīng)用受到了極大限制。目前在國內(nèi)由于結(jié)冷膠的研究起步較晚，雖然也有投資生產(chǎn)但生產(chǎn)技術(shù)較國外落后，產(chǎn)品質(zhì)量及產(chǎn)量相對較差。因此降低生產(chǎn)成本，提高結(jié)冷膠的質(zhì)量及產(chǎn)量一直都是結(jié)冷膠研究的關(guān)鍵。結(jié)冷膠的生物合成途徑已基本清晰，但對于其代謝調(diào)控規(guī)律依然還有許多問題要回答，因此，通過代謝調(diào)節(jié)基礎(chǔ)領(lǐng)域的研究，可以有效指導(dǎo)結(jié)冷膠生物合成途徑的修飾，調(diào)節(jié)微生物對結(jié)冷膠的生產(chǎn)、增加結(jié)冷膠的產(chǎn)量；利用遺傳工程和代謝工程對結(jié)冷膠代謝途徑進行重新設(shè)計，如基因打靶、RNAi基因沉默技術(shù)阻斷結(jié)冷膠合成過程中黃色類胡蘿卜素色素的生成。結(jié)冷膠發(fā)酵中后期，發(fā)酵液具有高度的粘性，因此降低攪拌的耗能也是一大難題。另外，結(jié)冷膠生產(chǎn)菌種退化速度較快也是一個不容忽視的問題，目前關(guān)于結(jié)冷膠菌種復(fù)壯的相關(guān)研究還很少，希望會有更多這方面的研究。

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