陳 剛

(湖南省張家界市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 張家界 427000)

清肝利膽排石丸系張家界市中醫(yī)院制劑注冊(cè)品種，協(xié)定處方由酸泡根、茵陳、虎杖、金錢草等12 味藥物組方，具有清肝利膽、排石止痛等功效，方中虎杖所含虎杖苷(又名白黎蘆醇苷)具有保肝、利膽和抗菌作用，主要用于治療膽石癥、膽囊炎、急慢性肝炎等病癥。該品種原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)比較簡(jiǎn)單，僅規(guī)定了性狀、薄層色譜鑒別等檢驗(yàn)項(xiàng)目，未制訂含量測(cè)定檢測(cè)指標(biāo)。為較好地控制制劑內(nèi)在質(zhì)量，筆者采用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)清肝利膽排石丸中虎杖之虎杖苷進(jìn)行含量測(cè)定?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

美國(guó)Waters E2695 型高效液相色譜儀，Waters2489 型UV 檢測(cè)器，Empower2 色譜工作站;AUW220D 型電子分析天平(日本島津);1020a 超純水機(jī)(重慶摩爾);KQ2200DB 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器公司)?；⒄溶諏?duì)照品(批號(hào)為111575-200502，供含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所);清肝利膽排石丸(張家界市中醫(yī)院制劑室，批號(hào)為130120，130502，131202);乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈-水(20 ∶80);檢測(cè)波長(zhǎng):306 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。理論板數(shù)按虎杖苷峰計(jì)應(yīng)不低于3 000。

2.2 溶液制備

取本品適量，研細(xì)，取約2.5 g，精密稱定，精密加入稀乙醇50 mL，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用稀乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。五氧化二磷干燥器中減壓干燥24 h，精密稱取虎杖苷對(duì)照品11.26 mg，置100 mL 容量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL 含0.112 6 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。另按處方組成[2]，制成缺虎杖的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn):精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液各10 μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果陰性對(duì)照品溶液色譜圖中，在虎杖苷峰相應(yīng)的保留時(shí)間附近無(wú)干擾峰，陰性無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:精密吸取虎杖苷對(duì)照品溶液(0.112 6 mg/mL)1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，7.0 mL，置10 mL 容量瓶中，加稀乙醇至刻度，搖勻，以0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，按上述色譜條件測(cè)定。以虎杖苷進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=4 251 854.351 7 X - 850.400 0，r=0.999 9(n=6)。結(jié)果表明，虎杖苷進(jìn)樣量在0.112 6 ～0.788 2 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，按上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定峰面積。結(jié)果的RSD 為0.71%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取同一供試品溶液10 μL，按上述色譜條件，分別在0，2，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定虎杖苷的峰面積。結(jié)果的RSD 為1.05%(n=6)，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批(批號(hào)為130120)樣品6 份，每份約2.5 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果平均含量為1.52 mg/g，RSD 為0.73%(n=6)，表明方法重復(fù)性較好。

加樣回收試驗(yàn):取已知含量(1.52 mg/g)樣品6 份，分別精密加入虎杖苷對(duì)照品溶液(0.112 6 g/L)5.0，10.0，15.0 mL，照供試品制備方法制成供試液，依法(進(jìn)樣10 μL)測(cè)定虎杖苷的含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 虎杖苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果( n=6)

2.4 樣品含量測(cè)定

取3 個(gè)不同批號(hào)(130120，130502，131202)的樣品，依法制備供試品溶液。分別精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定虎杖苷的峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。結(jié)果3 批次樣品中虎杖苷的含量分別為1.52，0.83，0.62 mg/g。

3 討論

以HPLC 法測(cè)定虎杖苷的含量，采用乙腈-水進(jìn)行梯度洗脫者較多，為使操作簡(jiǎn)化又不影響分析效果，選用乙腈-水等度系統(tǒng)作為流動(dòng)相。經(jīng)多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙腈-水(20 ∶80)為流動(dòng)相配比時(shí)，峰形較好，保留時(shí)間適中，能使本樣品中虎杖苷峰與相鄰色譜峰達(dá)到基線分離，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。

供試品溶液提取溶劑的選擇參照2010 年版《中國(guó)藥典(一部)》和文獻(xiàn)[3]進(jìn)行篩選，曾用不同濃度甲醇、乙醇分別進(jìn)行超聲、加熱回流提取。試驗(yàn)結(jié)果表明，以50%乙醇(稀乙醇)回流提取30 min，虎杖苷含量較高，重復(fù)性、穩(wěn)定性較好。

樣品含量在0.62 ～1.52 mg/g 之間，批次間差異懸殊，且近期產(chǎn)品含量較低。經(jīng)查，主要是生產(chǎn)過(guò)程中溫度控制不嚴(yán)所致。生產(chǎn)時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按工藝流程控制溫度，并不得隨意延長(zhǎng)干燥、烘烤時(shí)間，以確保質(zhì)量可靠、安全有效。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典(一部) [M]. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：194.

[2] 湘藥制字Z20080881，醫(yī)院制劑注冊(cè)審批確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)[S].

[3] 柯長(zhǎng)青，蔣永海. 高效液相色譜法測(cè)定金膽片中虎杖苷含量[J]. 中國(guó)藥業(yè)，2006，15(13)：33.