王艷廷, 冀曉昊, 張艷敏, 吳玉森, 安萌萌, 張 芮, 王立霞, 張 晶，劉 文,2, 李 敏, 李文燕, 陳學森,*

1 山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院,作物生物學國家重點實驗室, 泰安 271018

2 臨沂大學生命科學學院, 臨沂 276005

3 濟南軍區(qū)黃河三角洲生產(chǎn)基地, 東營 257231

自然生草對黃河三角洲梨園土壤物理性狀及微生物多樣性的影響

王艷廷1, 冀曉昊1, 張艷敏1, 吳玉森1, 安萌萌1, 張 芮1, 王立霞1, 張 晶1，劉 文1,2, 李 敏1, 李文燕3, 陳學森1,*

1 山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院,作物生物學國家重點實驗室, 泰安 271018

2 臨沂大學生命科學學院, 臨沂 276005

3 濟南軍區(qū)黃河三角洲生產(chǎn)基地, 東營 257231

以山東省東營市濟南軍區(qū)黃河三角洲生產(chǎn)基地自然生草4a、6a和9a的黃金梨[Pyruspyrifolia(Burm.f.).cv.Nakai]梨園耕作層土壤為試材，以清耕為對照，探討了多年自然生草對黃河三角洲梨園土壤物理性狀及微生物多樣性的影響。結果表明，自然生草能明顯提高耕作層土壤孔隙度，降低土壤容重和電導率(可溶性含鹽量)，而對土壤含水量沒有影響；自然生草增加了土壤微生物量C、N,通過PCR-DGGE及測序技術發(fā)現(xiàn)細菌主要增加的是未培養(yǎng)菌類；與清耕對照相比，多年自然生草梨園土壤微生物呼吸、活性、活躍微生物量、微生物磷酯脂肪酸總量提高效果明顯，但對微生物磷酯脂肪酸種類影響較小，處理間差異均不顯著；同時，自然生草提高了碳源利用能力，其中以生草4a最大，隨著生草年限增加，6類碳源利用更加均衡。綜上所述，自然生草優(yōu)化了黃河三角洲梨園耕作層土壤物理性狀，增加了微生物量C、N，其中細菌主要增加的是未培養(yǎng)菌類；同時，持續(xù)多年自然生草，有利于參試梨園土壤微生物呼吸、活性、活躍微生物量及磷酯脂肪酸總量的提高，并對微生物均衡利用6類碳源作用明顯。

自然生草; 梨園; 土壤物理性狀; 土壤微生物; 多樣性

近幾年研究表明，果園生草利于蓄水保肥、改善土壤結構、增加有機質(zhì)、提高土壤酶活、提升果品品質(zhì)、減少環(huán)境污染以及有效防治病蟲害等[1- 4],是我國當今果業(yè)可持續(xù)高效發(fā)展及生態(tài)農(nóng)業(yè)建設的重要組成部分[5]；在意大利、法國、美國及日本等果品生產(chǎn)先進國家的考察調(diào)研也發(fā)現(xiàn)，果園生草能夠全面綜合提高果園生產(chǎn)能力和效率，實現(xiàn)果園土壤可持續(xù)發(fā)展的良好生態(tài)和經(jīng)濟效益，在這些國家很難見到不生草果園[6- 11]。而土壤微生物作為土壤重要組成部分，參與土壤中約90%的土壤反應過程[12]，其中微生物量多少、微生物群落組成、活性等可以用來衡量土壤質(zhì)量好壞、肥力高低以及物質(zhì)代謝的旺盛程度，一定程度反映了作物對養(yǎng)分的吸收利用與生長發(fā)育狀況[13- 15]；同時，微生物作為土壤重要“源”和“匯”，還參與有機質(zhì)分解、pH變化、溫室氣體產(chǎn)生、毒素降解、土壤結構穩(wěn)定、功能維持、腐殖質(zhì)和團粒結構形成以及C、N、P、S等養(yǎng)分的循環(huán)與轉(zhuǎn)化，是土壤質(zhì)量評價指標體系中不可缺少的組成部分[16- 20]。因此，探討生草果園土壤微生物多樣性變化，對果園生草推廣及全面評價果園生草改良土壤效果具有重要意義。

前人就不同生草草種、生草模式對不同樹種果園土壤微生物影響進行了一定研究，吳家森等[21]研究生草山核桃林土壤微生物影響發(fā)現(xiàn)， 生草4a后土壤微生物量碳(MBC)增加了138.61%—159.68%，3種生草處理土壤微生物碳源利用AWCD顯著高于免耕；潘學軍等[22]對盆栽紐荷爾臍橙土壤微生物數(shù)量及酶活性的變化進行了測定，結果表明柑橘生育期內(nèi)，土壤微生物以細菌為主，真菌最少，間種綠肥提高了細菌和放線菌數(shù)量，自然生草則明顯提高了土壤中真菌數(shù)量，相關分析還表明微生物數(shù)量與土壤氮素及有機質(zhì)含量之間成顯著正相關；陳偉等[23]研究清耕蘋果園微生物特性發(fā)現(xiàn)，高產(chǎn)果園微生物數(shù)量多、多樣性好；吳紅英等[24]對間作不同芳香作物、自然生草條件下沙地梨園土壤微生物特性研究發(fā)現(xiàn)，間作芳香植物有效調(diào)節(jié)了土壤微生物數(shù)量及其群落中細菌、真菌和放線菌比例，且梨園間作香矢車菊和檸檬羅勒較自然生草調(diào)節(jié)效果更好。屬濱海鹽化潮土的山東東營濟南軍區(qū)黃河三角洲生產(chǎn)基地，含鹽量達0.3%—0.4%，曾采取“大坑深栽，清耕除草”方式發(fā)展果業(yè)，出現(xiàn)建園成活率低等問題；1993年從國外引進白三葉、黑麥草、高羊茅等10余種草種，進行果業(yè)發(fā)展-人工種草結合試探，因白三葉引發(fā)紅蜘蛛大爆發(fā)，黑麥草、高羊茅等根系發(fā)達，易引起表層土壤干燥等原因?qū)е略囼炗衷馐。?003年梨園嘗試自然生草，割草3—4次/a覆蓋于地表，并撒施7.5—10kg尿素/667m2，取得了省力、優(yōu)質(zhì)、高效的初步成效，得到了周圍果農(nóng)的認可[5- 6]。梁博等[25]研究自然生草對黃河三角洲梨園土壤pH的影響,發(fā)現(xiàn)生草能顯著降低株間和行間各土層土壤pH值,且隨生草年限的增加效果更好；本課題組吳玉森等[2]研究發(fā)現(xiàn)，自然生草降低黃河三角洲梨園0—40cm土層土壤含鹽量及增加土壤有機質(zhì)含量的同時，隨著生草年限增加有效提高了參試梨園耕作層(0—20cm)土壤酶活性及土壤礦質(zhì)營養(yǎng)元素含量，還提升了果實鮮食品質(zhì)，但有關黃河三角洲生產(chǎn)基地自然生草對梨園土壤物理性狀和微生物多樣性影響，至今未見研究報道。為此，本試驗以山東東營濟南軍區(qū)黃河三角洲生產(chǎn)基地自然生草4a、6a和9a的梨園耕作層土壤為試材，以清耕為對照，探討自然生草對梨園耕作層土壤物理性狀、微生物量、土壤微生物呼吸、活性、活躍微生物量、磷酯脂肪酸總量及土壤微生物碳源利用情況等的影響，旨在豐富生草果園土壤微生物多樣性理論研究體系，并為我國果園生草培肥地力技術的推廣應用提供理論支撐和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于2012—2013年在山東農(nóng)業(yè)大學作物生物學國家重點實驗室和東營市黃河三角洲濟南軍區(qū)基地三團十三分場進行，試材為17年生的黃金梨品種[Pyruspyrifolia(Burm.f.).cv. Nakai]，砧木為杜梨，栽植密度為2m×4m。試驗梨園面積14.7hm2，土壤為濱海鹽化潮土，2011年測得含鹽量0.3%，pH8.5，有機質(zhì)12.8mg/kg，全氮0.52g/kg，全磷0.20g/kg，全鉀21.58g/kg，堿解氮135mg/kg，速效磷20 mg/kg，速效鉀152 mg/kg，立地條件一致，常規(guī)管理[2]。

1.2 試驗處理

試驗設4個處理：連續(xù)自然生草4a、6a、9a和清耕；處理分別開始于2009年、2007年和2004年的春季進行全園自然生草，試驗小區(qū)面積分別為2.7、3.3、7.3 hm2，清耕小區(qū)為1.3 hm2。隨機區(qū)組設計，3次重復。各處理小區(qū)土壤及植株管理條件一致，以清耕為對照；草區(qū)刈割3—4次/a，就地覆蓋，每次割草后撒施7.5—10 kg尿素/667m2，以促進草的生長(給草施肥)，清耕區(qū)采用傳統(tǒng)的方法施入同量尿素。

1.3 自然生草地被植物群落及產(chǎn)草量見表1。

1.4 樣品采集及處理

試材隨機區(qū)組設計，3次重復。土壤樣品于2013年5月21日在各處理小區(qū)按5點取樣法，用土鉆取耕作層(0—20cm)土層土樣，各小區(qū)5個樣點混合均勻后作為1個土壤樣品，共12份土樣，剔除植物殘根等雜物后用無菌塑料袋裝好，帶回實驗室后分為3部分，一部分陰干、研磨、過篩保存；另一部分于-20℃冰箱保存，用于各類微生物指標的測定；第3部分在-80℃冰箱保存，用于細菌遺傳多樣性測定。

表1 自然生草地被植物群落及產(chǎn)草量

1.5 試驗測定指標及方法

1.5.1 土壤物理特性的測定

土壤含水量測定采用烘干法；容重測定采用環(huán)刀法；pH測定采用水土比2.5∶1酸度計測定；電導率采用水土比5∶1電導率儀測定；土壤孔隙度測定采用常規(guī)方法進行[26]。

1.5.2 微生物量及活性等的測定

(1)微生物量的測定

微生物量C測定采用(氯仿)熏蒸提取-容量分析法，微生物量N采用(氯仿)熏蒸提取-茚三酮比色法[27]。

(2)土壤活躍微生物量、微生物活性及土壤呼吸的測定

土壤活躍微生物量、微生物活性及土壤呼吸的測定采用王蕓等及高云超等的方法進行[28- 29]。其中土壤活躍微生物量測定采用呼吸曲線數(shù)學分析法,用葡萄糖培養(yǎng)基，其配方為葡萄糖3g、酵母膏0. 75g、NH4Cl 1.125g、MgSO47H2O0.3g、KH2PO40.25g、水1000mL，培養(yǎng)方法是1g新鮮土樣中添加0.4mL培養(yǎng)基, 20℃培養(yǎng)10h,測定CO2量，計算公式為：X0= 0.283YCO2×10h/干土百分率,X0為活動生物量(mg生物量干重/(kg土))。YCO2/10h為10h培養(yǎng)期內(nèi)CO2產(chǎn)生量〔mg-CO2kg-1干土 10h- 1)。另外,44mgCO2=22.4mL CO2；土壤微生物活性測定采用土壤呼吸CO2測定法，5g鮮土于310mL試劑瓶中, 22℃、24h測定CO2釋放量；土壤呼吸測定采用CO2釋放量法：取5 g鮮土于試劑瓶中, 28℃培養(yǎng)24 h后測CO2呼吸量。上述3個指標土壤均以干土重計算，測定儀器均為Portable Gas Analyser(ADC BioSientific Ltd)。

(3)微生物磷酯脂肪酸(PLFA)的測定

微生物磷酯脂肪酸(PLFA)的測定采用土壤微生物分析——FAME法(fatty acid methyl esters)[30]進行。具體為：將15mL的0.2mol/L KOH甲醇溶液和4g新鮮土壤加到50mL(或者35mL)離心管中，加蓋,在37℃下恒溫培育1h(脂肪酸釋放，并且甲酯化，每10min樣品渦懸20s/1次)；加3mL 1.0mol/L醋酸溶液中和pH值,充分搖勻。加10mL正己烷，(渦旋30s)混勻，使FAMEs轉(zhuǎn)到正己烷相中，800r/min離心15min將正己烷相轉(zhuǎn)到干凈試管中，在N2氣流下?lián)]發(fā)掉溶劑，將提取的FAMEs溶解于0.8 mL 1∶1 的正己烷∶甲基叔丁基醚(methyl-tertbutyl ether)溶液中，充分溶解3—5 min,轉(zhuǎn)入GC小瓶,同時加入10μL濃度為1mg/mL的內(nèi)標C19:0并上機測定,作GC-MS(Shimadzu GC/MS-QP 2010)分析。以十九烷酸(19:0為內(nèi)標)甲酯內(nèi)標進行定量計算。

1.5.3 土壤細菌遺傳多樣性的測定

(1)DGGE變性凝膠梯度電泳

①土壤DNA提取。采用OMEGA(Soil DNA Kit)試劑盒，具體按照試劑盒說明書進行。

②16SrDNA基因V8區(qū)PCR反應。以(1)中提取的DNA為模板，反應體系為50μL：2μL 10μmol/L 341F(5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCGCCTACGGGA GGCAGCAG- 3′)(下劃線線部分為GC clamp)，2μL 10μmol/L 907R(5′-CCGTCAATTCCTTTGA GTTT- 3′)[31]，1μL DNA模板，4μL dNTP，5μL PCR Buffer，r Taq酶0.25μL,補加超純水至50μL。PCR反應條件：94℃ 5 min；94℃ 1min，65℃ 3s，0.3℃/s降至55℃，55℃ 2s，72℃ 30s，10個循環(huán)；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，19個循環(huán)；72℃ 5min, 4℃保溫。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

③將各處理3平行PCR產(chǎn)物采用OMEGA公司Cycle-Pure Kit試劑盒回收純化為50μL，具體步驟參照說明書進行。

④采用Bio-Rad公司Dcode型梯度膠制備裝置，制備變性劑濃度從40%—70%的8%聚丙烯酰胺凝膠。待膠凝固后，加入PCR產(chǎn)物45μL和10×Loading Buffer 15μL的混合物，在80V電壓、60℃條件下電泳16h。

⑤電泳結束后將凝膠放在DuRed核酸染液(泡染法)染色40—50min。采用UVP(Gel Doc-It Imaging System)成像系統(tǒng)拍照，并用(Bio-Rad)軟件進行圖像分析。

(2)DGGE部分條帶測序

①選擇DGGE電泳圖中生草4—9a處理與對照相比亮度明顯增加的條帶(1—7共7條)進行回收測序。首先在紫外燈下快速切膠、搗碎置于1.5mL離心管(含900μL無菌水)中過夜；回收后進行PCR擴增并進行純化，擴增采用TIANGEN公司2×Taq PCR Master Mix試劑，方法及條件嚴格按其說明書進行。擴增引物為：341F(5′-CCTACGGGAGGCAGCAG- 3′)，907R(5′-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT- 3′)；

②擴增完成后同樣采用1.5.2中(3)的方法進行純化，然后采用TIAN GEN公司Zero Back Fast Ligation Kit及DH5α感受態(tài)細胞進行連接轉(zhuǎn)化并挑選單克隆體，具體步驟參照試劑盒說明書進行，特征條帶測序在英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進行測定。

1.5.4 微生物碳源利用的測定

微生物碳源利用的測定采用Biolog-Eco方法進行[32]。稱取10g新鮮土樣，在超凈工作臺中將土壤加至帶有玻璃珠，內(nèi)90mL滅菌0.85%NaCl溶液的三角瓶中，加蓋振蕩40min(轉(zhuǎn)速為250r/min)。靜置5min后按逐步稀釋法，依次稀釋為10-2、10-3土壤懸浮液．用八通道移液器向ECO板每孔中加入10-3的土壤懸浮液，接種量為150μL，將接種好的微孔板放在25℃下連續(xù)培養(yǎng)10d，每隔24h在590nm處用酶標儀(PerkinElmer USA)測定其光密度值，連續(xù)測定7d，選取96h(快速生長期)數(shù)據(jù)進行碳源利用分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

(1)本文所有試驗數(shù)據(jù)均為3次重復，并采用Excel 2003和DPS7.05數(shù)據(jù)分析軟件進行統(tǒng)計分析，并用鄧肯氏法進行多重比較，差異顯著性用不同大小寫字母表示；DGGE條帶使用quantity one- 4.6.2軟件分析，聚類分析采用非加權組平均法(UPGMA)；主成分分析采用SAS9.0軟件分析。

2 結果

2.1 自然生草不同年限對梨園土壤物理性狀的影響

自然生草不同年限梨園土壤物理性狀測定結果見表2。由表2可以看出，自然生草4—9a的總孔隙度是清耕對照的1.27倍，而土壤容重和電導率(可溶性含鹽量)分別僅是清耕對照的85%和59%，差異均達極顯著水平，各生草處理間差異不顯著；自然生草9a的土壤PH7.67，是清耕對照(7.95)的96%，差異達顯著水平，其他處理間差異不顯著，而所有處理間的土壤含水量差異均不顯著。

表2 自然生草不同年限對黃河三角洲梨園土壤物理特性的影響

同列中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

以上結果表明，自然生草明顯提高了梨園土壤孔隙度、降低了土壤容重和電導率(可溶性含鹽量)，而對土壤含水量沒有影響。

2.2 自然生草不同年限對梨園土壤微生物多樣性影響

2.2.1 土壤微生物量變化

自然生草不同年限梨園耕作層土壤微生物量測定結果見圖1。由圖1可以看出，清耕處理微生物量C、N含量均為最低，隨著生草年限增加微生物量C、N逐漸增加，生草處理微生物量C含量分別為清耕處理的1.40、1.76和2.86倍，微生物量N為清耕處理的1.25、1.53和2.07倍，其中生草4a微生物量C、N與清耕對照差異均不顯著，生草6—9a處理與清耕對照差異均達顯著水平。

圖1 微生物量C、NFig.1 Microbial biomass C, N不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2.2 土壤細菌遺傳多樣性變化

本試驗進一步通過DGGE-PCR方法對土壤細菌整體群落特點進行了測定。DGGE電泳結果見圖2。由圖2可以看出，與清耕對照相比，生草處理條帶數(shù)量增多，亮度明顯增亮。

DGGE條帶聚類分析結果見圖3。由圖3可以看出，4種不同生草年限處理共聚為3類，首先清耕對照單獨聚為一類，其次生草4a處理聚為一類，最后生草6a和9a聚為一類。

圖2 16SrDNA 基因V8區(qū)DNA片段的DGGE分離Fig.2 16SrDNA gene V8 region separated by DGGE

圖3 細菌DGGE膠片條帶的聚類分析Fig.3 Cluster dendrogram analysis of DGGE bands in gel

選擇生草4—9a處理與對照相比亮度明顯增加的條帶(1—7共7條)進行測序比對，條帶測序比對結果(表3)。由表3可知，比對結果與已發(fā)表序列的相似性達到91%—100%，7條帶共測定出16個序列，其中有13個序列為未培養(yǎng)菌類，占到總序列數(shù)的81%，即增加的多為未培養(yǎng)菌類。其中有球形桿菌科(Sphaerobacteraceae)、浮霉狀菌目(Planctomycetales)、浮霉狀菌(planctomycete)、(Chitinophagaceae)鞘脂桿菌目、(Comamonadaceae)叢毛單胞菌科及(Chitinophaga)泉發(fā)菌科等細菌菌類。

細菌遺傳多樣性指數(shù)結果見表4。由表4可以看出，生草4—9a處理條帶數(shù)量增多，多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)逐漸提高，如生草4a多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)分別是清耕的1.14倍和1.35倍，生草9a是清耕的1.22倍和1.44倍；但生草處理對均勻性指數(shù)E影響不明顯。

PCR-DGGE結果總體說明，自然生草有利于增加黃河三角洲梨園土壤未培養(yǎng)細菌種類和數(shù)量，隨著生草年限的延長，細菌群落向豐富性、多樣性發(fā)展。

2.2.3 土壤微生物呼吸、活性、活躍微生物量及微生物磷酯脂肪酸種類、總量變化

自然生草不同年限梨園耕作層土壤微生物呼吸、活性、活躍微生物量、微生物磷酯脂肪酸(PLFA)種類及總量測定結果見表5。由表5可以看出，生草4a微生物活性、活躍微生物量及微生物磷酯脂肪酸總量與清耕對照差異不顯著，但生草6—9a處理土壤微生物呼吸、活性、活躍微生物量及微生物磷酯脂肪酸總量分別為清耕對照的2.26倍、2.75倍、1.86倍和1.57倍，差異達顯著或極顯著，但生草6a和9a處理二者間比較差異均不顯著；而較清耕對照，生草處理對微生物磷酯脂肪酸(PLFA)種類影響較小，相互間差異均不顯著。

表3 測序及比對結果

表4 遺傳多樣性指數(shù)變化

表5 微生物呼吸、活躍微生物量、活性及微生物磷酯脂肪酸種類、總量變化

綜上，持續(xù)多年自然生草有利于梨園耕作層土壤微生物呼吸、活性、活躍微生物量及微生物磷酯脂肪酸總量等的提高。

2.3 自然生草不同年限對梨園土壤微生物碳源利用的影響

Biolog-ECO板的碳源共為6類31種，不同年限自然生草梨園土壤微生物對6類碳源的利用情況見圖4。由圖4可知，不同處理對6類碳源利用情況差異明顯。清耕土壤微生物對聚合物類利用程度很高，但對碳水化合物類和胺類利用程度很低，而生草處理對碳水化合物利用程度很高，對胺類利用程度卻很低；各處理間清耕碳源利用程度最低，生草4a處理6類碳源利用程度最高，但各類碳源利用差異最大；生草6a處理6類碳源利用更為均衡，除聚合物類與胺類之間利用差異顯著外，其余任兩種碳源之間利用差異都不顯著；而生草9a處理6類碳源利用程度較小，但碳源利用最為均衡，6類碳源兩兩之間利用差異均不顯著。

上述結果表明，自然生草改變了土壤微生物碳源利用結構，提高了6類碳源利用能力，其中以生草4a為最大，隨著生草年限增加，6類碳源利用更加均衡。

圖4 同一生草年限土壤微生物對不同碳源的利用情況Fig.4 Microbial utilization of different carbon sources in grass soil of the same years

2.4 板孔平均顏色變化率動態(tài)變化

吸光值平均顏色變化率(AWCD值)某種程度上反映了土壤中快速生長微生物對單一碳源利用能力，能真實反映出快速生長微生物同化分解有機碳的能力。連續(xù)培養(yǎng)10d，每隔24h測得AWCD值見圖5。

圖5 不同生草年限處理土壤微生物碳源利用AWCD值動態(tài)變化Fig.5 The different grass life processing carbon utilization of soil microorganismsdynamic change of AWCD value

由圖5可知，總體上不同處理都表現(xiàn)為AWCD值隨培養(yǎng)時間的延長而不斷提高。其中，前期(24—72h)增長比較緩慢，緊接著(72—120h)增長迅速，后期(120h后)則增長緩慢并且逐漸趨于平穩(wěn)。在連續(xù)培養(yǎng)10d中微生物群落代謝的AWCD值隨時間變化曲線的形狀符合一般微生物利用基質(zhì)的規(guī)律,即存在較明顯的適應期、對數(shù)期和穩(wěn)定期等階段。在培養(yǎng)10d時間里，生草4—9a處理AWCD值均明顯高于清耕對照；生草處理間，吸光值生草4a最高、生草6a與其接近，生草9a次之。

上述結果表明，與清耕對照相比，自然生草能有效提高黃河三角洲梨園快速生長微生物碳源利用能力(AWCD值)，其中生草4a提高幅度最大，生草6a與之接近，生草9a次之。

圖6 不同生草年限處理土壤微生物碳源利用主成分分析Fig.6 The different grass life treatment soil microbial carbon source using principal component analysis

2.5 主成分分析

BIOLOG的主成分分析顯示了微生物群落對碳源利用的整體響應，是反映土壤微生物群落結構特征的有效手段。選擇96 h(快速生長期)測定的吸光值進行主成分分析(PCA)。前3個主成分累計方差貢獻率達到了100%，根據(jù)提取的主成分個數(shù)一般要求累計方差貢獻率達到85%，提取主成分特征值大于1的原則，共提取了2個主成分，評價各處理土壤微生物群落在碳源利用上的整體差異。第一和第二主成分累計貢獻率達93.01%。因此本文對前2個主成分進行分析(圖6)。其中，第一主成分貢獻率為69.45%，第二主成分貢獻率為23.56%。

由圖6可以看出，不同處理間土壤微生物群落對碳源利用能力差異明顯，表現(xiàn)在它們在PC1和PC2的得分系數(shù)差異巨大，即位于不同象限。整體上看，與清耕對照相比，各生草處理空間位置都在向PC1和PC2正方向移動,即生草處理后微生物碳源利用變化趨勢一致。

3 討論

3.1 自然生草對梨園土壤微生物量及碳源利用等的影響

土壤微生物量是指土壤中除植物根茬等殘體和大于5×103μm3土壤動物以外具有生命活力的有機物質(zhì)的量[34], 其代表參與土壤能量和養(yǎng)分循環(huán)以及有機物質(zhì)轉(zhuǎn)化所對應微生物的數(shù)量，主要類群為細菌、真菌、放線菌、藻類和原生動物等。主要有兩方面的功能:一方面微生物量是土壤有機質(zhì)及土壤養(yǎng)分(N、P、S等)轉(zhuǎn)化和循環(huán)的動力,參與土壤有機質(zhì)分解、腐殖質(zhì)形成、土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、循環(huán)的各個過程；另一方面土壤微生物量是土壤養(yǎng)分(N、P、S)的貯備庫,是植物生長所需速效養(yǎng)分的重要來源[35]。本試驗發(fā)現(xiàn)生草處理后土壤微生物量C、N逐年增加，微生物量C含量分別為清耕處理的1.40、1.76和2.86倍，微生物量N為清耕處理的1.25、1.53和2.07倍，生草6—9a處理與清耕對照差異均達顯著水平，這與前人[21- 22]研究結果類似，微生物量的明顯提高，表明土壤肥力的不斷改善。

本試驗進一步對微生物碳源利用情況進行了測定，結果(圖4)發(fā)現(xiàn)生草4—9a處理碳源利用程度均高于清耕對照，這與前人研究結果基本一致[21]。分析是生草后大量凋落物歸還土壤，這些凋落物及土壤中根系分泌物富含營養(yǎng)物質(zhì)，再加上生草后昆蟲、土壤動物數(shù)量增加從而形成了碳源代謝能力較強的微生物群落結構，而清耕土壤，由于清耕除草導致有機物質(zhì)歸還量較低、土壤團聚體破壞、有機碳礦化加快，同時由于地面裸露導致水土流失嚴重、耕作層溫度變化幅度大等原因，不利于微生物生長繁殖。各處理間，生草4a碳源利用程度最高，但6類碳源利用差異巨大，而生草6—9a處理6類碳源利用卻更為均衡；分析認為生草4a處理植物殘體、根系分泌物等猛然積累提供了微生物所需各類營養(yǎng)物質(zhì)，土壤溫度變化幅度減小，適于微生物生存繁殖，土壤中原有優(yōu)勢菌群數(shù)量迅速變化，導致生草4a碳源利用為最大。同時，各種類草、昆蟲及土壤動物等多因素競爭加劇，導致生草4a處理6類碳源利用情況差異巨大，而在生草6—9a草、根系分泌物種類、數(shù)量等等因素逐漸趨于動態(tài)平衡，從而生草6—9a 6類碳源利用情況比較均衡、穩(wěn)定；另外，盡管Biolog-ECO板技術測定微生物碳源利用情況已廣泛用于微生物的研究，但其僅適合快速生長微生物，且碳源種類也具有很大人為選擇性，難以反映生長緩慢及不可培養(yǎng)微生物碳源利用情況[36- 37]。因此，有必要結合新方法從不同角度對自然生草土壤微生物碳源利用做進一步研究，從而得到更為全面結果。

PCR-DGGE技術是從微生物基因多樣性角度研究微生物群落結構的方法，DGGE條帶數(shù)量基本體現(xiàn)了微生物種群數(shù)量，而條帶亮度則反映了該菌類數(shù)量的多少[38]。本試驗DGGE圖譜可以看出，生草4—9a處理較清耕對照土壤細菌數(shù)量、種類都明顯增加，進一步對生草后明顯增亮條帶通過回收、轉(zhuǎn)克隆及測序技術得出81%為未培養(yǎng)菌類，其中包括球形桿菌科(Sphaerobacteraceae)、浮霉狀菌目(Planctomycetales)、鞘脂桿菌目(Chitinophagaceae)、叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)、浮霉狀菌(planctomycete)及泉發(fā)菌科(Chitinophaga)等細菌菌類。有研究表明(Comamonadaceae)叢毛單胞菌科細菌對COD和氨氮具有很好去除能力，對好氧顆粒污泥除污能力具有很好的強化作用[39]；浮霉狀菌目(Planctomycetales) 是細菌域中分化較早的一個分支，該目包括2個科9個屬，其中4個屬歸入 (Planctomycetaceae) 浮霉狀菌科,為化能異養(yǎng)型好氧菌[40]，本試驗測序結果中也檢測到了 (Planctomycetaceae) 浮霉狀菌科序列，這也說明生草后土壤通氣狀況的改善。與此同時，由于測序結果多是未培養(yǎng)菌類，難以獲得其在土壤中的生態(tài)功能，想進一步了解這些優(yōu)勢菌群的結構功能和種屬特性，需做更深入的研究。未培養(yǎng)菌類可能在自然生草改良梨園土壤過程中起主要作用,是下一步研究的重點和切入點。

3.2 自然生草對梨園土壤微生物呼吸、活躍微生物量及微生物總量的影響

羅海峰等[41]認為可培養(yǎng)微生物種類占土壤微生物種類總數(shù)的0.1%—1%，且分離培養(yǎng)方法難以全面反映土壤微生物多樣性的原始狀態(tài)等，本試驗對梨園土壤微生物呼吸、活躍微生物量及微生物磷酯脂肪酸總量(PLFA總量)等進行了測定。土壤呼吸主要是由土壤微生物的活動引起，代表土壤碳素的周轉(zhuǎn)速率及微生物的整體活性[42]；活躍微生物量是土壤中存在的少部分生理功能活躍微生物,這部分微生物一般不到總量的1/3[28]。本試驗結果(表5)發(fā)現(xiàn)生草4a活躍微生物量及微生物磷酯脂肪酸總量與清耕對照差異不明顯，但生草6—9a土壤微生物呼吸、活躍微生物量及微生物磷酯脂肪酸總量分別為清耕對照的2.26倍、2.75倍、1.86倍和1.57倍，差異均達顯著或極顯著。分析認為土壤呼吸的提高一方面是由于活躍微生物量、微生物總量(plfa總量)的增加引起，這在表5中可以看出；另一方面土壤呼吸、活躍微生物量的變化主要受土壤溫度和土壤通透性影響，有關試驗證據(jù)表明，幾乎所有研究都顯示土壤溫度強烈地影響土壤微生物活性和呼吸[43]；對麥田和玉米田的土壤呼吸研究得出土壤呼吸受5cm地溫的影響最大[44- 45]；高云超[29]等于不同年份免耕試驗中發(fā)現(xiàn)影響土壤活躍微生物量的主要因素是土壤通透性或營養(yǎng)因素，并且李會科等[46]研究得出果園生草能有效調(diào)節(jié)5—20cm土層土壤溫度變化，明顯減小了溫度波動范圍；進一步分析認為溫度影響土壤微生物呼吸、活躍微生物量的機理是溫度與土壤酶活性存在密切關系，溫度過高或過低均會造成生物酶失活或活性降低，致使微生物活性下降。這也從微生物角度說明自然生草有助于增加土壤營養(yǎng)狀況，改善土壤通透性，減小土壤溫度波動范圍。

4 結論

(1)自然生草優(yōu)化了黃河三角洲梨園耕作層土壤物理性狀，增加了微生物量C、N，其中細菌主要增加的是未培養(yǎng)菌類；

(2)持續(xù)多年自然生草，有利于參試梨園土壤微生物呼吸、活性、活躍微生物量及磷酯脂肪酸總量的提高，并對微生物均衡利用6類碳源作用明顯。

[1] 李會科, 張廣軍, 趙政陽, 李凱榮. 渭北黃土高原旱地果園生草對土壤物理性質(zhì)的影響. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2008, 41(7): 2070- 2076.

[2] 吳玉森, 張艷敏, 冀曉昊, 張芮, 劉大亮, 張宗營, 李文燕, 陳學森. 自然生草對黃河三角洲梨園土壤養(yǎng)分、酶活性及果實品質(zhì)的影響. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2013, 46(1): 99- 108.

[3] 趙政陽, 李會科. 黃土高原旱地蘋果園生草對土壤水分的影響. 園藝學報, 2006, 33(3): 481- 484.

[4] 霍穎, 張杰, 王美超, 姚允聰. 梨園行間種草對土壤有機質(zhì)和礦質(zhì)元素變化及相互關系的影響. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2011, 44(7): 1415- 1424.

[5] 陳學森, 王艷廷. 力推果園生草, 建設生態(tài)文明. 煙臺果樹, 2014, (1): 1- 4.

[6] 陳學森, 高東升, 辛力, 原永兵, 劉成連, 李文燕. 給果園小草一點陽光, 蘋果更燦爛——蘋果果實品質(zhì)提升的途徑與關鍵技術. 落葉果樹, 2012, 44(3): 1- 4.

[7] 陳學森, 蘇桂林, 姜遠茂, 毛志泉. 可持續(xù)發(fā)展果園的經(jīng)營與管理——再談果園生草培肥地力及其配套技術. 落葉果樹, 2013, 45(1): 1- 3.

[8] 陳學森, 韓明玉, 蘇桂林, 劉鳳之, 過國南, 姜遠茂, 毛志泉, 彭福田, 束懷瑞. 當今世界蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨勢及我國蘋果產(chǎn)業(yè)優(yōu)質(zhì)高效發(fā)展意見. 果樹學報, 2010, 27(4): 598- 604.

[9] 陳學森, 郝玉金, 楊洪強, 毛志泉, 姜遠茂, 彭福田, 沈向, 張繼祥, 陳曉流, 束懷瑞. 我國蘋果產(chǎn)業(yè)優(yōu)質(zhì)高效發(fā)展的10項關鍵技術. 中國果樹, 2010, (4): 65- 67.

[10] Whitelaw-Weckert M A, Rahman L, Hutton R J, Coombes N. Permanent swards increase soil microbial counts in two Australian vineyards. Applied Soil Ecology, 2007, 36(2/3): 224- 232.

[11] Moreno B, Garcia-Rodriguez S, Caizares R, Castro J, Benítez E. Rainfed olive farming in south-eastern Spain: Long-term effect of soil management on biological indicators of soil quality. Agriculture, Ecosystems and Environment, 2009, 131(3/4): 333- 339.

[12] Coleman D C, Crossley D A. Fundamentals of Soil Ecology. London: Academic Press, 1996.

[13] Knight B P, McGrath S P, Chaudri A M. Biomass carbon measurements and substrate utilization patterns of microbial populations from soil amended wish cadmium, copper, or zinc. Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63(1): 39- 43

[14] 趙彤, 閆浩, 蔣躍利, 黃懿梅, 安韶山. 黃土丘陵區(qū)植被類型對土壤微生物量碳氮磷的影響. 生態(tài)學報, 2013, 33(18): 5615- 5622.

[15] 郭天財, 宋曉, 馬冬云, 查菲娜, 岳艷軍, 張煜, 李耀昭. 氮素營養(yǎng)水平對小麥根際微生物及土壤酶活性的影響. 水土保持學報, 2006, 20(3): 129- 131,140- 140.

[16] Green J L, Holmes A J, Westoby M, Oliver I, Briscoe D, Dangerfield M, Gillings M, Beattie A J. Spatial scaling of microbial eukaryote diversity. Nature, 2004, 432(7018): 747- 750.

[17] Nachimuthu G, King K, Kristiansen P, Lockwood P, Guppy C. Comparison of methods for measuring soil microbial activity using cotton strips and a respirometer. Journal of Microbiological Methods, 2007, 69(2): 322- 329.

[18] 孫波, 趙其國, 張?zhí)伊? 俞慎. 土壤質(zhì)量與持續(xù)環(huán)境-Ⅲ. 土壤質(zhì)量評價的生物學指標. 土壤, 1997, 29(5): 225- 234.

[19] 孔維棟, 朱永官, 傅伯杰, 陳保冬, 童依平. 農(nóng)業(yè)土壤微生物基因與群落多樣性研究進展. 生態(tài)學報, 2004, 24(12): 2894- 2900.

[20] 申衛(wèi)收, 林先貴, 張華勇, 尹睿, 段增強, 施衛(wèi)明. 不同施肥處理下蔬菜塑料大棚土壤微生物活性及功能多樣性. 生態(tài)學報, 2008, 28(6): 2682- 2689.

[21] 吳家森, 張金池, 錢進芳, 黃堅欽. 生草提高山核桃林土壤有機碳含量及微生物功能多樣性. 農(nóng)業(yè)工程學報, 2013, 29(20): 111- 117.

[22] 潘學軍, 張文娥, 樊衛(wèi)國, 蓬桂華, 羅國華. 自然生草和間種綠肥對盆栽柑橘土壤養(yǎng)分、酶活性和微生物的影響. 園藝學報, 2010, 37(8): 1235- 1240.

[23] 陳偉, 姜中武, 胡艷麗, 束懷瑞. 蘋果園土壤微生物生態(tài)特征研究. 水土保持學報, 2008, 22(3): 168- 171.

[24] 吳紅英, 孔云, 姚允聰, 畢寧寧, 亓麗萍, 付占國. 間作芳香植物對沙地梨園土壤微生物數(shù)量與土壤養(yǎng)分的影響. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2010, 43(1): 140- 150.

[25] 梁博, 劉成連, 王永章, 李文燕, 原永兵. 黃河三角洲梨園自然生草對土壤PH的影響. 中國農(nóng)學通報, 2014, 30(1): 143- 148.

[26] 杜森, 高祥照. 土壤分析技術規(guī)范. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2006.

[27] 李振高, 駱永明, 滕應. 土壤與環(huán)境微生物研究法. 北京: 科學出版社, 2008.

[28] 王蕓, 李增嘉, 韓賓, 史忠強, 寧堂原, 江曉東, 鄭延海, 白美, 趙建波. 保護性耕作對土壤微生物量及活性的影響. 生態(tài)學報, 2007, 27(8): 3384- 3390.

[29] 高云超, 朱文珊, 陳文新. 秸稈覆蓋免耕土壤細菌和真菌生物量與活性的研究. 生態(tài)學雜志, 2001, 20(2): 30- 36.

[30] Johnson C K, Wienhold B J, Doran J W, Drijber R A, Wright S F. Linking microbial-scale findings to farm-scale outcomes in a dryland cropping system. Precision Agriculture, 2004, 5(4): 311- 328.

[31] Muyzer G, Brinkhoff T, Nubel U, Santegoeds C, Sch?fer H, Wawer C. Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) in microbial ecology // Kowalchuk G A, de Bruijn F J, Head I M, Akkermans A D, van Elsas J D. Molecular Microbial Ecology Manual. 2nd ed. 2004, 1(1/2): 743- 769.

[32] 董立國, 袁漢民, 李生寶, 袁海燕, 潘占兵. 玉米免耕秸稈覆蓋對土壤微生物群落功能多樣性的影響. 生態(tài)環(huán)境學報, 2010, 19(2): 444- 446.

[33] 秦華, 李國棟, 葉正錢, 徐秋芳, 曹志洪. 集約種植雷竹林土壤細菌群落結構的演變及其影響因素. 應用生態(tài)學報, 2010, 21(10): 2645- 2651.

[34] Jenkinson D S, Ladd J N. Microbial biomass in soil: measurement and turnover // Soil Biochemistry. New York: Marcel Dekker, 1981, (5): 451- 471.

[35] 張海燕, 張旭東, 李軍, 王冬梅. 土壤微生物量測定方法概述. 微生物學雜志, 2005, 25(4): 95-99.

[36] Konopka A, Oliver L, Turco R F Jr. The use of carbon substrate utilization patterns in environmental and ecological microbiology. Microbial Ecology, 1998, 35(2): 103- 115.

[37] 李春格, 李曉鳴, 王敬國. 大豆連作對土體和根際微生物群落功能的影響. 生態(tài)學報, 2006, 26(4): 1144- 1150.

[38] 胡元森, 吳坤, 劉娜, 陳紅歌, 賈新成. 黃瓜不同生育期根際微生物區(qū)系變化研究. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2004, 37(10): 1521- 1526.

[39] 李建婷, 紀樹蘭, 劉志培, 秦振平, 劉纓, 楊媛媛. 16SrDNA克隆文庫方法分析好氧顆粒污泥細菌組成. 環(huán)境科學研究, 2009, 22(10): 1218- 1223.

[40] 鄭平, 張蕾. 厭氧氨氧化菌的特性與分類. 浙江大學學報: 農(nóng)業(yè)與生命科學版, 2009, 35(5): 473- 481.

[41] 羅海峰, 齊鴻雁, 薛凱, 張洪勛. PCR-DGGE技術在農(nóng)田土壤微生物多樣性研究中的應用. 生態(tài)學報, 2003, 23(8): 1570- 1575.

[42] Su H M, Li X Y, He B H, Ouyang Y. Rainfall effects on soil microbial biomass and soil respiration under different land use conditions. Journal of Soil and Water Conservation, 2011, 25(6): 92-95.

[43] 肖輝林, 鄭習健. 土壤變暖對土壤微生物活性的影響. 土壤與環(huán)境, 2001, 10(2): 138- 142.

[44] 王立剛, 邱建軍, 李維炯. 黃淮海平原地區(qū)夏玉米農(nóng)田土壤呼吸的動態(tài)研究. 土壤肥料, 2002, (6): 13- 17.

[45] 張文佺, 王磊, 顏一青, 李艷麗, 王紅麗, 賈建偉. 不同農(nóng)業(yè)耕作模式下崇明鹽堿土壤低碳化改良效應的模型評價. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報, 2010, 29(5): 1006- 1014.

[46] 李會科, 梅立新, 高華. 黃土高原旱地蘋果園生草對果園小氣候的影響. 草地學報, 2009, 17(5): 615- 620.

Effects of self-sown grass on soil physical properties and microbial diversity of pear orchards in yellow river delta

WANG Yanting1, JI Xiaohao1, ZHANG Yanmin1, WU Yusen1, AN Mengmeng1, ZHANG Rui1, WANG Lixia1, ZHANG Jing1, LIU Wen1,2, LI Min1, LI Wenyan3, CHEN Xuesen1,*

1StateKeyLaboratoryofCropBiology，CollegeofHorticultureScienceandEngineering,ShandongAgriculturalUniversity,Taian271018,China2CollegeofLifeScience,LinyiUniversity,Linyi276005,China3ProductionbaseofJinanMilitaryRegionintheYellowRiverDelta,Dongying257231,China

In this study, we investigated the effects of natural grass growth on the physical properties of soil and microbial diversity in a pear orchard located in the yellow river delta. The soil properties and microbe diversity in orchards containing grass grown for 4, 6, and 9 years respectively, was characterized and compared with those in soil from orchards that did not have grass growth, which served as the control in this experiment. The results showed that multiple years of grass growing significantly enhanced soil porosity and reduced soil bulk density and conductivity, suggesting that permitting growth of natural grass in the orchard could reduce soluble salts in soil, without an influence on water content in the soil. Grass growth also increased the microbial mass C and N. By employing PCR-DGGE and sequencing technology, we found that the majority of the increased bacteria were species that could not be cultured. In comparison with control, the microbial respiration and activity, and the global phospholipid fatty acid concentration was increased after several years of grass growth, although the phospholipid fatty acid varieties were not affected, and no significant differences were found among treatments. Meanwhile, grass growth also improved carbon utilization capacity, with the most significant effect being displayed after 4 years implementation, and the more balanced utilization of six carbons were simultaneously achieved during this process.In summary, our study shows that the culture of naturally grown grass in the orchard significantly increases microbial biomass C, N, and microbe diversity, and that uncultured species constitute the major part of the increased bacterial concentration. Moreover, sustained grass culture in the orchard benefits the up-regulation of soil microbial activity and respiration and the increasing amount of active microbes and total phospholipid fatty acids. It is also effective at stimulating the balanced utilization of six carbons by microbes.

natural grass growing; pear orchard; soil physical property; soil microbe; diversity

國家重點基礎研究發(fā)展計劃課題(2011CB100606); 山東省水果創(chuàng)新團隊項目(SDAIT-03-022-01); 山東省自然基金(青年項目)(ZR2011CQ038)

2014- 02- 22;

日期:2014- 10- 08

10.5846/stxb201402220306

*通訊作者Correspondingauthor.E-mail:chenxs@sdau.edu.cn

王艷廷, 冀曉昊, 張艷敏, 吳玉森, 安萌萌, 張 芮, 王立霞, 張晶，劉文, 李敏, 李文燕, 陳學森.自然生草對黃河三角洲梨園土壤物理性狀及微生物多樣性的影響.生態(tài)學報,2015,35(16):5374- 5384.

Wang Y T, Ji X H, Zhang Y M, Wu Y S, An M M, Zhang R, Wang L X, Zhang J, Liu W, Li M, Li W Y, Chen X S.Effects of self-sown grass on soil physical properties and microbial diversity of pear orchards in yellow river delta.Acta Ecologica Sinica,2015,35(16):5374- 5384.