王 勇， 文 菀， 李永輝

（海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南海口571199）

正交試驗(yàn)優(yōu)選裸花紫珠葉中苯乙醇苷類成分的水提取工藝

王 勇， 文 菀， 李永輝

（海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南?？?71199）

目的優(yōu)選裸花紫珠葉中苯乙醇苷類成分的水提取工藝。方法以浸膏得率和毛蕊花糖苷及異毛蕊花糖苷的提取得率為評價(jià)指標(biāo)，考察浸泡時(shí)間、加水倍量、提取時(shí)間、提取次數(shù)等因素，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選最佳水提取工藝。結(jié)果裸花紫珠葉水提取最佳工藝為藥材加水浸泡2 h、提取3次、加水倍量分別為20、15、15，每次提取1 h。結(jié)論優(yōu)選出的水提取工藝簡單可行，可用于裸花紫珠葉中苯乙醇苷類成分的提取。

裸花紫珠；苯乙醇苷；正交試驗(yàn)；提取工藝

裸花紫珠為馬鞭草科紫珠屬植物裸花紫珠Callicarpa nudiflora Hook Et Arn.的干燥葉及嫩枝，為海南大宗道地藥材之一，也是海南黎族醫(yī)生常用的止血藥材之一。裸花紫珠性涼、味苦澀，具有抗菌、止血、涼血、清熱解毒、散瘀消腫之功效，主治各種炎癥、外傷出血、跌打腫痛、風(fēng)濕腫痛、肺結(jié)核咳血、胃腸出血等癥［1］。紫珠屬植物的化學(xué)成分研究表明，苯乙醇苷類成分是該屬植物的主要類群成分之一［2］。裸花紫珠具有較強(qiáng)的止血作用，其中的苯乙醇苷類化合物——毛蕊花糖苷（acteoside，AS）和異毛蕊花糖苷（isoacteoside，IAS）有顯著縮短活化部分凝血活酶時(shí)間 （APTT）作用，提示裸花紫珠可能是通過影響內(nèi)源性凝血途徑來發(fā)揮止血作用，其中毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷在藥材中的含有量很高，可能是裸花紫珠止血的主要活性成分［3］。本研究采用正交設(shè)計(jì)，以浸膏得率，毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的提取得率為指標(biāo)，綜合評價(jià)，篩選裸花紫珠葉中苯乙醇苷類成分的水提取工藝，為裸花紫珠葉及其制劑的進(jìn)一步研究開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 儀器與材料

6CH-18茶葉烘焙箱 （福建安溪興民機(jī)械有限公司）；AL-104電子天平 （梅特勒-托利多儀器 （上海）有限公司）；XS105 Dua1Range分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；98-1-B電子調(diào)溫電熱套 （天津市泰斯特儀器有限公司）；九陽電磁爐 （九陽股份有限公司）；202AB-1電熱干燥箱（上海申光儀器儀表有限公司），Shimadzu LC-2010AHT高效液相色譜儀 （配有紫外檢測器，自動(dòng)進(jìn)樣器，LC so1ution色譜工作站）。甲醇、醋酸、無水乙醇均為分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠，乙腈為色譜純，水為超純水。毛蕊花糖苷 （批號120804）與異毛蕊花糖苷對照品（批號130512）購自四川維克奇生物科技有限公司。裸花紫珠藥材于2013年8月采自海南省白沙縣，經(jīng)作者鑒定為馬鞭草科紫珠屬植物裸花紫珠C.nudiflora Hook Et Arn.的干燥葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材水分測定 取裸花紫珠葉粗粉3份，每份約2 g，精密稱定 （2.061 2、2.047 5、2.049 4 g），按 《中國藥典》2010年版附錄Ⅸ水分測定法第一法烘干法測定［4］，水分分別為9.61%、10.22%、9.77%，平均水分為9.87%。

2.2 浸膏得率的測定 精密量取裸花紫珠提取后濃縮液25 mL置已干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，并于105℃加熱干燥3 h，迅速轉(zhuǎn)移至干燥器中冷卻0.5 h，稱定質(zhì)量，計(jì)算浸膏得率 （扣除藥材水分，以干燥藥材計(jì)）。

2.3 毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的測定

2.3.1 色譜條件［5-8］Luna C18（2）色譜柱 （150 mm× 4.6 mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%醋酸水溶液（15∶85）；體積流量1.0mL/min，檢測波長332 nm；柱溫30℃。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密稱取毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷對照品，置25 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成每1mL含毛蕊花糖苷0.103 2mg、異毛蕊花糖苷0.103 6 mg的混合對照品溶液。取適量，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液進(jìn)樣，進(jìn)樣體積分別為2、4、8、10、12、16、20μL，測定毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷的峰面積，分別以毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷的進(jìn)樣量 （μg）為橫坐標(biāo) （X）、峰面積為縱坐標(biāo) （Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到毛蕊花糖苷的回歸方程為Y=1 788 946.61X-42 034.33，r=1.000 0，線性范圍為0.206 4～2.064μg；異毛蕊花糖苷的回歸方程為Y=1 724 575.34X-49 469.72，r= 1.000 0，線性范圍為0.207 2～2.072μg。

2.3.3 樣品測定 取裸花紫珠提取后濃縮液0.5 mL，置25mL量瓶中，加入50%甲醇稀釋至刻度。取適量，過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，測定，記錄色譜圖，計(jì)算毛蕊花糖苷 （AS）和異毛蕊花糖苷 （IAS）量及提取得率（扣除藥材水分，以干燥藥材計(jì)）。

對照品和供試品溶液色譜圖如圖1所示。

圖1 對照品（A）和供試品（B）溶液的HPLC色譜圖

2.4 藥材浸泡時(shí)間考察 取剪碎后的裸花紫珠葉4份，每份20 g，分別加入20倍量蒸餾水浸泡0.5、2、4、12 h，加熱回流提取2次，第1次2 h，第2次加入15倍量蒸餾水回流提取1 h，200目濾布濾過，合并兩次濾液，加熱濃縮，濃縮液冷卻后，加蒸餾水定容至100 mL。按 “2.2”項(xiàng)和“2.3.3”項(xiàng)分別測定浸膏得率、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的提取得率。結(jié)果見表1。浸泡時(shí)間對于浸膏得率影響不大，但浸泡時(shí)間為2 h時(shí)AS+IAS得率最高，從而選擇浸泡時(shí)間為2 h。

表1 藥材浸泡時(shí)間考察結(jié)果

2.5 藥材水提取工藝因素與水平 裸花紫珠葉中主要苯乙醇苷類成分毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷易溶于水，因此采用水加熱回流提取方法，考察加水量，回流時(shí)間和提取次數(shù)3個(gè)因素，每個(gè)因素考察3個(gè)水平，因素水平見表2。

表2 正交試驗(yàn)的因素與水平

2.6 提取工藝正交試驗(yàn)方法與結(jié)果 取剪碎后的裸花紫珠葉9份，每份20 g，依次編號為1～9試驗(yàn)組。藥材均先浸泡2 h后，按照表3中L9（34）正交表規(guī)定的條件進(jìn)行回流提取，提取液均用200目紗布濾過，合并濾液，加熱濃縮，濃縮液冷卻后，加蒸餾水定容至100 mL，搖勻。按 “2.2”項(xiàng)方法測定浸膏得率，按 “2.3.3”項(xiàng)方法測定毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的含有量，測定結(jié)果見表3。以綜合評分值為指標(biāo)，對結(jié)果進(jìn)行方差分析，列出方差分析表，見表4。

比較各因素的極差可知，因素C（提取次數(shù)）對試驗(yàn)結(jié)果影響最大，其次是A和B，所以因素對綜合評分值指標(biāo)影響大小排序?yàn)镃＞A＞B。由方差分析可知，因素C具有顯著性差異。根據(jù)極差分析各因素的均值，可確定裸花紫珠藥材水提取最佳工藝為A3B2C3，即藥材浸泡時(shí)間2 h后，提取3次，加水量分別為20，15，15倍量，每次提取時(shí)間為1 h。

表3 提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

2.7 工藝驗(yàn)證性試驗(yàn) 稱取裸花紫珠藥材3份，每份50 g，按上述確定的最佳工藝條件提取，對藥材水提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證，測定結(jié)果見表5。結(jié)果表明，由上述確定的最佳方案提取苯乙醇苷類化合物提取率較高，該方案較穩(wěn)定。

表5 藥材水提取工藝驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

在考察色譜條件時(shí)，參考文獻(xiàn) ［5-8］考察了乙腈-0.1%醋酸 （20∶80、18∶82、17∶83、16∶84）不同比例的流動(dòng)相，結(jié)果供試品溶液中毛蕊花糖苷色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均不理想，最后選用乙腈-0.1%醋酸（15∶85），毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷分離度均較好。

選取測定指標(biāo)時(shí)，曾參考文獻(xiàn) ［9-10］選取了3種苯乙醇苷類化合物毛蕊花糖苷、連翹酯苷B、異毛蕊花糖苷和1種黃酮苷類化合物木犀草苷，結(jié)果毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷在裸花紫珠水提取液中含有量比較高，而連翹酯苷B和木犀草苷含有量相對較低，且與相鄰色譜峰未達(dá)基線分離，未選用這兩個(gè)成分為指標(biāo)，因此最終選擇以毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷作為測定指標(biāo)。

在處理數(shù)據(jù)時(shí)，引進(jìn)綜合評價(jià)的理念，將2個(gè)評價(jià)指標(biāo)轉(zhuǎn)化成一個(gè)數(shù)值，這種多指標(biāo)綜合加權(quán)評分法可以避免單一評價(jià)的片面性，使分析結(jié)果更加科學(xué)、客觀，使得提取工藝趨于合理、可信［11］。本研究以浸膏得率、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的提取得率為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)確定了裸花紫珠葉的浸泡時(shí)間，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)合綜合評分法［12-14］，對裸花紫珠葉中苯乙醇苷類成分的水提取工藝進(jìn)行研究，確定了最佳的提取工藝：藥材加水浸泡2 h，提取3次，加水倍量分別為20、15、15，每次提取1 h。由于裸花紫珠葉的吸水率較大 （4.8 mL/g），故在選擇加水量的水平時(shí)第1次加入量比后兩次大。本研究確定的提取工藝簡單可行，3次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性較好，可為裸花紫珠葉中苯乙醇苷類成分的提取提供參考。

裸花紫珠葉水提取所得浸膏得率較高，達(dá)35%以上，提取物 （液）雜質(zhì)較多，需采用離心、醇沉、絮凝或大孔樹脂分離純化等方法進(jìn)一步除雜。兩種苯乙醇苷類成分含有量較文獻(xiàn) ［9］報(bào)道的高，可能與藥材采收季節(jié)、產(chǎn)地、提取方法、提取溶劑和提取時(shí)間等因素有關(guān)。另外異毛蕊花糖苷在提取物 （液）中的相對含有量隨著提取時(shí)間的延長會(huì)增加。這兩種異構(gòu)體在加熱提取過程中是否會(huì)發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，還需進(jìn)一步研究。

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R284.2

B

1001-1528（2015）08-1856-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.052

2014-05-12

海南省自然科學(xué)基金 （813192）

王 勇 （1982—），男，碩士，副研究員，從事南藥與黎藥化學(xué)成分、提取工藝與質(zhì)量控制研究。Te1：（0898）66895337，E-mai1：wangyong1982-2004@a1iyun.com