左彥珍， 孫大永， 畢紅東， 丁 實(shí)， 周 健， 魯艷杰

（1.承德醫(yī)學(xué)院藥理教研室，河北 承德067000；2.承德市中心醫(yī)院放化療中心，河北 承德067000；3.承德醫(yī)學(xué)院病理教研室，河北承德067000）

二氫楊梅素誘導(dǎo)凋亡抗腫瘤作用

左彥珍1， 孫大永2*， 畢紅東1， 丁 實(shí)1， 周 健1， 魯艷杰3

（1.承德醫(yī)學(xué)院藥理教研室，河北 承德067000；2.承德市中心醫(yī)院放化療中心，河北 承德067000；3.承德醫(yī)學(xué)院病理教研室，河北承德067000）

目的以HeLa細(xì)胞為研究對(duì)象，研究二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）的誘導(dǎo)凋亡作用，進(jìn)一步研究和驗(yàn)證DMY誘導(dǎo)腫瘤凋亡的作用和機(jī)制，為探索研發(fā)治療宮頸癌新藥提供思路的同時(shí)，對(duì)DMY在抗腫瘤方面的應(yīng)用提供進(jìn)一步的資料。方法倒置顯微鏡觀察給藥后細(xì)胞形態(tài)的變化，MTT實(shí)驗(yàn)研究DMY對(duì)于HeLa細(xì)胞的抗腫瘤作用，流式細(xì)胞術(shù)研究DMY對(duì)HeLa細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，Western b1otting檢測(cè)促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bc1-2表達(dá)水平，進(jìn)一步探討其機(jī)制。結(jié)果DMY濃度越大，對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用越明顯，48 h的IC50約125μg/m1；流式細(xì)胞術(shù)顯示在DMY為140μg/mL時(shí)HeLa細(xì)胞凋亡明顯；Western b1otting結(jié)果顯示DMY可誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)增加，同時(shí)Bc1-2蛋白減少。結(jié)論DMY可以通過誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。

二氫楊梅素；細(xì)胞凋亡；宮頸癌；流式細(xì)胞術(shù)

二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）是葡萄科藤茶植物黃酮提取物中的主要活性成分二氫黃酮類化合物，近些年研究顯示DMY可以通過抑制侵襲、抗增殖、促凋亡等機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤的作用，很可能成為一種低毒高效的抗腫瘤藥物。另外有研究顯示黃酮類化合物還可以增加腫瘤放化療的敏感性［1］。宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，2008年的統(tǒng)計(jì)資料顯示，宮頸癌是女性第三常見的惡性腫瘤，居?jì)D科惡性腫瘤發(fā)病率首位，新發(fā)病例52.9萬(wàn)，85%發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，死亡病例27.4萬(wàn)［2］，且近二十年來(lái)發(fā)病日趨年輕化，嚴(yán)重威脅著女性的身體健康和生命。手術(shù)、放療、化療和綜合治療是治療癌癥的主要手段。手術(shù)治療是早、中期宮頸癌的一種重要治療手段，有較好的治療效果，但經(jīng)根治術(shù)治療后約有30%未控或者復(fù)發(fā)［3］。手術(shù)輔以化療能夠提高治愈率，降低復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，提高生存率，改善患者生存質(zhì)量［4］，但是目前臨床上常用的化療藥物多為順鉑、5-氟尿嘧啶等細(xì)胞毒類藥物，毒副作用比較重。本研究以HeLa細(xì)胞為對(duì)象，研究二氫楊梅素對(duì)宮頸癌的抗腫瘤作用，探索二氫楊梅素誘導(dǎo)腫瘤凋亡的作用和機(jī)制，以期探索和研發(fā)新的抗宮頸癌藥物，為提高宮頸癌的治愈率提供新思路，同時(shí)也為二氫楊梅素在抗腫瘤方面的應(yīng)用開發(fā)提供進(jìn)一步的資料。

1 材料

二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)照品，批號(hào)MUST-13013108，純度99%以上。改良型RPMI-1640培養(yǎng)液、PBS磷酸鹽緩沖液、胎牛血清 （FBS）均購(gòu)自HyC1one公司，0.25%胰酶（Sigma），培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板（Corning），流式細(xì)胞凋亡試劑盒（聯(lián)科生物）。Bc1-2和Bax為兔抗人單克隆抗體（EPITOMICS公司）。宮頸癌HeLa細(xì)胞系由承德醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌HeLa細(xì)胞加入含100 U/m L青霉素和100μg/mL鏈霉素的10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿的80%左右，用0.25%含EDTA的胰酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)。

2.2 MTT法檢測(cè)二氫楊梅素對(duì)HeLa細(xì)胞抗增殖作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化收集細(xì)胞，并將細(xì)胞密度調(diào)整至1× 104個(gè)/mL，按照實(shí)驗(yàn)的不同分組，于96孔板中每孔接種0.1mL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別設(shè)空白組、對(duì)照組和不同藥物濃度組。24 h后細(xì)胞貼壁并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將培養(yǎng)基換成含不同濃度二氫楊梅素的等體積培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，在培養(yǎng)結(jié)束前4 h每孔加入5 mg/mLMTT 10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心棄培養(yǎng)基，每孔加入150μL DMSO，使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀490 nm處檢測(cè)各孔吸光度，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（抑制率=對(duì)照組OD-藥物組OD）/對(duì)照組OD×100%），并利用IC50軟件計(jì)算藥物的IC50值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，取平均值。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞，以不同濃度二氫楊梅素作用48h后用不含EDTA的胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，按照流式凋亡試劑盒的步驟收集細(xì)胞，并加入相應(yīng)的AV、PI染色，用BD FACSCa1ibur流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488nm處檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，并用隨機(jī)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 Western b1otting檢測(cè)Bax和Bc1-2的蛋白表達(dá) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞給予不同質(zhì)量濃度二氫楊梅素 （0、100、140 μg/mL）作用48 h，加入裂解液充分裂解，低溫反復(fù)凍融3次，4℃，12 000 r/min離心15 min，取上清，提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量，SDS-PAGE電泳，穩(wěn)壓電泳進(jìn)行聚偏乙烯 （PVDF）膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗按一定比例稀釋后 （Bc1-2、Bax：1∶1 000，βactin：1∶1 000）4℃孵育過夜，分別加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG（1∶5 000）室溫孵育1 h，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL），顯影，免疫印跡條帶應(yīng)用Quntity One 4.62軟件進(jìn)行定量分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)處理軟件SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以表示，選取P＜0.05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 二氫楊梅素對(duì)HeLa細(xì)胞形態(tài)的影響 不同質(zhì)量濃度二氫楊梅素對(duì)HeLa細(xì)胞處理48 h后，可見空白對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁良好，細(xì)胞間隙小，形態(tài)均一，呈胖三角形團(tuán)簇狀生長(zhǎng)，克隆增殖良好；隨著二氫楊梅素質(zhì)量濃度的增高，細(xì)胞固縮變圓，細(xì)胞間隙明顯增大，貼壁能力下降，克隆增殖能力下降明顯，細(xì)胞密度同對(duì)照組相比明顯減少（圖1）。

圖1 不同質(zhì)量濃度二氫楊梅素作用HeLa細(xì)胞48 h后形態(tài)變化 （×40）

3.2 MTT法檢測(cè)二氫楊梅素對(duì)HeLa細(xì)胞的抗增殖作用

不同質(zhì)量濃度二氫楊梅素作用48 h后，HeLa細(xì)胞的增殖明顯被抑制 （P＜0.05），且隨著二氫楊梅素質(zhì)量濃度的增加，抑制作用越顯著，其IC50約125μg/mL。見圖2。

圖2 二氫楊梅素對(duì)HeLa細(xì)胞的體外抗增殖作用（n=6）

3.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)二氫楊梅素對(duì)HeLa細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用 流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，經(jīng)不同質(zhì)量濃度的二氫楊梅素 （0、100、140μg/mL）干預(yù)48 h后，HeLa細(xì)胞的凋亡率分別為15.36%±2.6%、35.43%±1.6%、75.08%± 5.8%，可見隨著藥物質(zhì)量濃度的增加，凋亡也越明顯（P＜0.01），尤其140μg/m L組大部分細(xì)胞已經(jīng)凋亡 （P＜0.01），見圖3。

3.4 Western b1otting檢測(cè)蛋白表達(dá) β-actin條帶各組表達(dá)均一，總蛋白量相同。二氫楊梅素干預(yù)后，可見隨著藥物質(zhì)量濃度的增加，Bax表達(dá)逐漸增加，Bc1-2表達(dá)逐漸減少，尤其140μg/mL組顯著（P＜0.05）；與MTT結(jié)果一致（圖4）。

4 討論

細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和治療中起著重要的作用，通過誘導(dǎo)和調(diào)控凋亡通路來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是目前治療腫瘤的一個(gè)重要途徑［5］。另外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是黃酮類化合物增加放化療治療敏感性，降低治療副反應(yīng)的重要途徑之一［1］。二氫楊梅素是我國(guó)近幾年開發(fā)的新的黃酮類化合物，有研究顯示二氫楊梅素可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞AGZY-83-a凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用［6］。研究黃酮類化合物二氫楊梅素通過誘導(dǎo)凋亡途徑在HeLa細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用不僅可以為宮頸癌的治療提供新的思路，也可以進(jìn)一步明確二氫楊梅素發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制，為二氫楊梅素在抗腫瘤和腫瘤增敏治療藥物開發(fā)利用方面提供實(shí)驗(yàn)資料。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)AV/PI雙染檢測(cè)不同質(zhì)量濃度二氫楊梅素誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞的凋亡（n=3）

圖4 Western blotting檢測(cè)不同質(zhì)量濃度二氫楊梅素作用后Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)（n=3）

MTT實(shí)驗(yàn)顯示二氫楊梅素在體外對(duì)HeLa細(xì)胞有抗增殖作用，并且隨著藥物質(zhì)量濃度的增加作用也越顯著。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是藥物發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機(jī)制之一，因此實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了二氫楊梅素對(duì)HeLa細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，結(jié)果同MTT一致，隨著藥物濃度的增加HeLa細(xì)胞凋亡率也明顯增加。

Bc1-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡調(diào)控信號(hào)中起著重要作用，按其功能主要分為兩大類：即促凋亡蛋白Bax、Bak、Bid和抗凋亡蛋白Bc1-2、Bc1-xL等［7］。Bc1-2可通過調(diào)控細(xì)胞膜通透性來(lái)阻止細(xì)胞色素C釋放，從而阻止細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Bc1-2的高表達(dá)已成為腫瘤細(xì)胞逃逸凋亡的重要機(jī)制之一，抑制Bc1-2表達(dá)可明顯上調(diào)腫瘤細(xì)胞的凋亡率。而凋亡蛋白Bax的功能恰恰相反，位于細(xì)胞質(zhì)的Bax受到凋亡信號(hào)的刺激后，形成二聚體并插入線粒體膜，從而誘導(dǎo)線粒體膜的電位降低，促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放，誘發(fā)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)［8］。Bc1-2與Bax可相互拮抗，當(dāng)細(xì)胞受到促凋亡因素刺激時(shí)，兩者的比率決定細(xì)胞的存亡［9］。當(dāng)Bc1-2/Bax比值上調(diào)時(shí)，細(xì)胞對(duì)死亡的信號(hào)反應(yīng)性就會(huì)降低，從而使凋亡受到抑制；Bc1-2/Bax比值下調(diào)時(shí)，細(xì)胞對(duì)死亡信號(hào)的反應(yīng)性增強(qiáng)，促進(jìn)了凋亡的發(fā)生［10］。在甘草酸對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的研究中顯示下調(diào)抑凋蛋白Bc1-2表達(dá)和上調(diào)促凋蛋白Bax表達(dá)可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡［11］；白藜蘆醇可以通過提高Bc1-2/Bax蛋白表達(dá)比減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡［12］；槲皮素可以通過調(diào)控Bax蛋白增加和Bc1-2蛋白減少而抑制小細(xì)胞肺癌H446的增殖并促進(jìn)其凋亡［13］。本研究中蛋白印跡結(jié)果顯示二氫楊梅素質(zhì)量濃度越高Bax蛋白表達(dá)量越高，而Bc1-2蛋白表達(dá)則減少。提示MTT實(shí)驗(yàn)中二氫楊梅素抗增殖和流式實(shí)驗(yàn)中二氫楊梅素誘發(fā)凋亡可能與下調(diào)Bc1-2/Bax比值有關(guān)。由此可見，二氫楊梅素與其他黃酮類化合物一樣都能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這種促進(jìn)凋亡的作用與下調(diào)Bc1-2/Bax比值有關(guān)。

綜上所述，本研究顯示二氫楊梅素對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞有抗腫瘤作用，其機(jī)制可能與激活了Bc1-2/Bax參與調(diào)控的凋亡通路有關(guān)。二氫楊梅素發(fā)揮抗腫瘤作用是否還與其它通路有關(guān)需要進(jìn)一步研究，另外二氫楊梅素在體內(nèi)是否也能發(fā)揮抗腫瘤作用我們將做進(jìn)一步研究。但是有研究顯示二氫楊梅素不僅在體外能夠抑制乳腺癌等腫瘤細(xì)胞的增殖［14］，活體條件下也可以顯著抑制人肺癌GLC82裸鼠移植瘤和人肝癌Be1-7402裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)［15-16］，并且劉德育等發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素在不產(chǎn)生毒素的作用下就可以顯著抑制黑色素瘤細(xì)胞B16的侵襲黏附，對(duì)黑色素瘤的抑制作用與目前臨床抗黑色素瘤的首選藥氮烯咪胺相當(dāng)［17］。蘇東林等［18］在二氫楊梅素的急性毒理學(xué)評(píng)價(jià)中也發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素毒性很小，毒副作用不明顯，Wistar大鼠口服灌胃的最大耐受量為5.0 g/kg。并且二氫楊梅素低毒高效的同時(shí)還有保護(hù)肝臟、降血脂、抗氧化、提高免疫力等優(yōu)點(diǎn)［19］。這些都提示二氫楊梅素在作為抗癌藥物開發(fā)利用方面有巨大潛力。但是藤茶和二氫楊梅素的研究近幾年剛剛開始，加之藤茶主要產(chǎn)于我國(guó)，國(guó)外鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果二氫楊梅素體外抗宮頸癌作用的存在可以為二氫楊梅素在抗腫瘤方面的應(yīng)用開發(fā)提供進(jìn)一步的資料，并可為我國(guó)開發(fā)天然植物抗腫瘤藥提供新思路。

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1001-1528（2015）08-1849-04

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2014-11-12

河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目 （QN2014036）；河北省衛(wèi)生廳重點(diǎn)課題 （ZL20140247）；承德市科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（20142015）；承德醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)項(xiàng)目 （201407）；河北省高校病理與病理生藥學(xué)重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目 （冀教高2013）

左彥珍（1981—），女，碩士，講師，主要從事腫瘤藥物研究。Te1：（0314）42291149，E-mai1：yanzhen926@163.com

*通信作者：孫大永 （1980—），男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤臨床研究。Te1：（0314）2020075，E-mai1：109024380@qq.com