唐 霖， 吳立新， 汪 俊， 孫振蛟*

（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江 寧波 315100；2.寧波立華植物提取技術(shù)有限公司，浙江 寧波315100）

枸杞多糖對電離輻射小鼠睪丸組織損傷的保護作用

唐 霖1， 吳立新2， 汪 俊2， 孫振蛟2*

（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江 寧波 315100；2.寧波立華植物提取技術(shù)有限公司，浙江 寧波315100）

目的觀察枸杞多糖對X射線電離輻射小鼠睪丸組織損傷的保護作用。方法雄性昆明小鼠隨機分為正常組、模型組、枸杞多糖低劑量和高劑量組，給藥組動物分別按照0.25 g/kg和1 g/kg劑量灌胃枸杞多糖，其余組動物灌胃蒸餾水，每日一次。第7天小鼠經(jīng)水合氯醛麻醉仰臥位固定，僅睪丸部位接受X射線照射 （3.0 Gy），正常組小鼠僅麻醉不照射。照射后各組小鼠繼續(xù)灌胃藥物，第21天處死動物取睪丸及附睪，稱定質(zhì)量并觀察精子活力、精子密度以及睪丸生精小管結(jié)構(gòu)。結(jié)果枸杞多糖各組小鼠一般狀況均優(yōu)于模型組，枸杞多糖高劑量組小鼠睪丸質(zhì)量與模型組比較明顯增加，精子數(shù)量和活力明顯升高，組織病理學(xué)顯示枸杞多糖高劑量組小鼠睪丸生精小管內(nèi)含大量精子，部分區(qū)域見少量生精細胞脫落。結(jié)論枸杞多糖對X射線所致的小鼠睪丸組織損傷有明顯的保護作用。

枸杞多糖；X射線；電離輻射；睪丸組織

放射療法與外科手術(shù)和化學(xué)療法共同構(gòu)成腫瘤治療三大療法，由于機體不同組織細胞對放射線敏感性差異，因而在放射治療同時會對正常組織細胞產(chǎn)生損傷。睪丸生精細胞對電離輻射非常敏感，以精原干細胞最敏感，其次為精母細胞，而精子細胞和成熟精子耐受力較高。當受到射線照射后，睪丸中的精子數(shù)量就會減少，可暫時不育，甚至可永久不育［1］。由于睪丸生精細胞對電離輻射的這種高度敏感性，臨床上應(yīng)用電離輻射治療男性患者腹部癌癥時，常常伴隨有少精、無精、暫時不育甚至永久不育、以及性功能障礙等并發(fā)癥［2-3］。

枸杞作為傳統(tǒng)的強精健體之補藥，《本草綱目》記載“枸杞，補腎生精，養(yǎng)肝；明目安神，令人長壽”。據(jù) 《中國藥典》2010年版一部所載，枸杞為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果實；甘，平；滋補肝腎，益精明目，用于虛勞精虧，腰膝酸痛，眩暈耳鳴，陽萎遺精，內(nèi)熱消渴，血虛萎黃，目昏不明，同時規(guī)定含枸杞多糖不得少于1.8%［4］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明枸杞多糖有抗衰老［5］、抗腫瘤［6］、抗疲勞［7］、增強機體免疫力［8］、降血脂［9］、降血糖［10］、改善性功能［11］等作用，最近研究表明枸杞多糖對糖尿病雄性大鼠生殖損傷有保護作用［12］，但對電離輻射的雄性生殖損傷是否有保護作用卻未見報道。本實驗通過探討枸杞多糖對電離輻射小鼠睪丸病理性損傷的保護作用，為枸杞多糖用于生殖保健提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 藥物與試劑 枸杞多糖，寧波立華植物提取技術(shù)有限公司提供 （批號20121201），含枸杞多糖以葡萄糖計不低于90%；蘇木精-伊紅染液和福爾馬林固定液均購于上海滬峰化工有限公司。

1.2 動物 健康雄性昆明小鼠，體質(zhì)量 （25±2）g，SPF級，由浙江大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號SYXK（浙）2007-009。

1.3 實驗儀器 正置光學(xué)顯微鏡 （日本奧林巴斯公司）；切片機 （德國萊卡公司）；便攜式X射線機 （意大利基拉多尼公司）。

2 實驗方法

2.1 造模及分組給藥 雄性小鼠40只，隨機分成正常組、模型組、枸杞多糖低和高劑量組，每組10只。照射造模前枸杞多糖低和高劑量組動物分別按照0.25 g/kg和1 g/kg灌胃給予枸杞多糖，每日1次，連續(xù)7 d，正常組和模型組給與相應(yīng)體積的生理鹽水。小鼠采用水合氯醛 （350 mg/kg）麻醉，仰臥位固定在有機玻璃板上，除睪丸外各部分采用1mm鉛板保護，電壓200 kV，電流15 mA，距離40 cm，吸收劑量率0.96 Gy/min，總劑量3.0 Gy。正常組動物僅接受麻醉處理。照射后繼續(xù)給藥3周，末次給藥后2 h處死動物，摘取睪丸、附睪，做相關(guān)檢測。

2.2 精子密度和活力測定［13］將盛有6 mL生理鹽水的試管置于恒溫水浴箱內(nèi)預(yù)熱至37℃，然后將一側(cè)附睪剪碎放入試管中，搖勻，37℃保溫15min，使精子充分游離。取1滴適當稀釋后滴人血細胞計數(shù)板上，200倍顯微鏡下計數(shù)5個中方格內(nèi)精子數(shù) （n），每1mL精子數(shù)為n×5×稀釋倍數(shù)×10。另取1滴涂片，觀察精子活率，至少觀察200個精子，分別計數(shù)有活動力及無活動力的精子數(shù)。精子活率=活動精子數(shù)/（活動精子數(shù)+不動精子數(shù)）×100%。

2.3 睪丸組織病理學(xué)檢查 取新鮮的睪丸組織，采用4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，蘇木精-伊紅染色，光鏡下進行病理學(xué)檢查。

3 結(jié)果

3.1 枸杞多糖對電離輻射模型小鼠大體狀況及睪丸重量的影響 模型小鼠在睪丸照射處理后自主活動減少并豎毛，3～5 d逐漸恢復(fù)正常，而枸杞多糖低、高劑量組小鼠自主活動與豎毛狀況優(yōu)于模型組。同時實驗開始時和結(jié)束時各組小鼠體質(zhì)量基本一致，而實驗結(jié)束時模型對照組小鼠睪丸與空白對照組比較明顯減輕 （P＜0.01），而枸杞多糖高劑量組與模型組比較顯著增加 （P＜0.05），見表1。

表1 枸杞多糖對電離輻射小鼠體質(zhì)量和睪丸質(zhì)量的影響 （n=10，）

表1 枸杞多糖對電離輻射小鼠體質(zhì)量和睪丸質(zhì)量的影響 （n=10，）

注：與空白對照組比較，##P＜0.01；與模型對照組比較，*P＜0.05

/mg空白對照組組別 劑量/（g·kg-1） 體質(zhì)量/g開始 結(jié)束 睪丸質(zhì)量25.3±2.4 37.4±3.1 212.2±18.5模型對照組 - 24.9±2.1 36.5±2.9 148.4±21.7##枸杞多糖低劑量組 0.25 25.8±2.3 36.8±3.3 157.8±15.3枸杞多糖高劑量組 1 25.6±2.5 37.7±3.6 170.1±19.3 -*

3.2 枸杞多糖對電離輻射模型小鼠精子質(zhì)量影響 由表2所示，小鼠睪丸接受X射線照射后精子密度與活力均明顯下降，與正常組比差異有顯著性意義 （P＜0.05，P＜0.05）。而連續(xù)灌胃枸杞多糖21 d后，枸杞多糖低、高劑量組小鼠精子密度與活力與模型組比較有升高趨勢，其中高劑量組精子密度與活力與模型組比較均明顯升高 （P＜0.05，P＜0.05）。

表2 枸杞多糖對電離輻射小鼠精子質(zhì)量影響 （n=10，）

表2 枸杞多糖對電離輻射小鼠精子質(zhì)量影響 （n=10，）

注：與空白組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

組別 劑量/（g·kg-1）精子密度/（×106·mL-1）精子活力/ % - 35.1±4.1 72.1±6.8模型對照組 - 18.6±2.6# 43.5±5.1#枸杞多糖低劑量組 0.25 21.2±3.1 46.6±5.9枸杞多糖高劑量組 1 25.6±2.9* 65.6±7.1空白對照組*

3.3 枸杞多糖對電離輻射模型小鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)的影響 如圖1所示，正常組小鼠曲精細管內(nèi)各期生精細胞排列整齊、緊密、有序，層次分明，精原細胞小而圓，緊貼曲精管的基底膜，向內(nèi)依次為初級精母細胞、精子細胞和精子，同時支持細胞形態(tài)正常。經(jīng)X射線照射的模型組小鼠睪丸生精小管生精上皮明顯變薄，生精細胞脫落，細胞層次紊亂，精原細胞、精母細胞減少，精子細胞及精子減少更加明顯，睪丸間質(zhì)細胞輕度水腫。枸杞多糖組尤其以高劑量組小鼠睪丸生精小管內(nèi)含大量精子，生精細胞排列稍疏松，結(jié)構(gòu)清楚，層次分明，細胞層次減少，精原細胞數(shù)量正常，形態(tài)圓而規(guī)則，緊貼在生精小管的基底膜，其他各期生精細胞數(shù)量略減少，部分區(qū)域見少量生精細胞脫落。

圖1 枸杞多糖對電離輻射模型小鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)的影響

4 討論

本研究表明枸杞多糖可改善睪丸接受3.0 Gy劑量X射線照射小鼠模型的一般狀況，增加模型小鼠睪丸質(zhì)量，提高精子數(shù)量和活力；組織病理學(xué)顯示枸杞多糖高劑量組小鼠睪丸生精小管內(nèi)含大量精子，部分區(qū)域見少量生精細胞脫落。以上研究結(jié)果表明枸杞多糖對X射線所致的小鼠睪丸組織損傷有明顯的保護作用。

機體分子、細胞、組織和器官受電離輻射影響所造成形態(tài)和功能的后果稱為輻射生物效應(yīng)，損傷效應(yīng)程度與機體各組織的輻射敏感性密切相關(guān)，其中性腺是最為敏感組織之一。研究早已證實電離輻射可導(dǎo)致睪丸生精上皮、附睪上皮、生精小管上皮出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)改變，破壞睪丸生精過程［14］。本研究也證實小鼠睪丸在X射線照射后精子密度與活力均明顯下降，睪丸生精小管生精上皮明顯變薄，生精細胞脫落，細胞層次紊亂，精原細胞、精母細胞減少，精子細胞及精子減少更加明顯，睪丸間質(zhì)細胞輕度水腫。小鼠在照射前灌胃枸杞多糖并持續(xù)到照射后14 d可改善模型小鼠自主活動與豎毛狀況，增加模型小鼠睪丸質(zhì)量，枸杞多糖低、高劑量組小鼠精子密度與活力與模型組比較有升高趨勢，其中高劑量組精子密度與活力與模型組比較均明顯升高。枸杞多糖高劑量組小鼠睪丸生精小管內(nèi)含大量精子，生精細胞排列稍疏松，結(jié)構(gòu)清楚，層次分明，細胞層次減少，精原細胞數(shù)量正常，形態(tài)圓而規(guī)則，緊貼在生精小管的基底膜，其他各期生精細胞數(shù)量略減少，部分區(qū)域見少量生精細胞脫落。枸杞多糖可增加睪丸損傷大鼠血清性激素水平，提高大鼠睪丸組織SOD活性和降低丙二醛含量，使受損的睪丸組織恢復(fù)到接近正常，這可能是枸杞多糖保護睪丸電離輻射損傷的作用機理［15］。

綜上所述，枸杞多糖對X射線所致的小鼠睪丸組織損傷有明顯的保護作用，為枸杞多糖用于生殖保健提供科學(xué)依據(jù)，同時為治療電離輻射所致生殖功能障礙的藥物開發(fā)提供了新的方向。

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R285.5

B

1001-1528（2015）08-1846-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.049

2014-03-29

高等學(xué)校訪問工程師校企合作項目 （2012）

唐 霖（1976—），女，碩士，講師，研究方向為天然產(chǎn)物研究與應(yīng)用。Te1：（0574）88222795，E-mai1：tang1@mai1.zjpc. net.cn

*通信作者：孫振蛟 （1979—），男，工程師，研究方向為天然產(chǎn)物研究與應(yīng)用。Te1：（0574）86503230，E-mai1：sunzhenjiao1@ 163.com