吳 浩， 彭 昕， 張煜炯， 王忠華

（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江寧波315100；2.浙江萬里學(xué)院，浙江寧波315100）

蛋白質(zhì)電泳指紋圖譜在各產(chǎn)地貝母親緣關(guān)系研究中的應(yīng)用

吳 浩1， 彭 昕1， 張煜炯1， 王忠華2*

（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江寧波315100；2.浙江萬里學(xué)院，浙江寧波315100）

目的研究浙貝母和其他產(chǎn)地貝母品種的親緣關(guān)系。方法采用蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳指紋技術(shù)，對具有代表性的7個品種 （系）浙貝及東貝、皖貝、川貝這3種近緣藥用貝母 （共30份個體）進(jìn)行分析。結(jié)果10種貝母的基因多樣性指數(shù)為0.333 4，Shannon信息指數(shù)為0.490 2，多態(tài)位點百分率 （PPB）為85.71%。結(jié)論浙貝母的寬葉、輪葉、狹葉、梅園和新梅園品種間的相似性系數(shù)在0.772 2～0.933 2之間，其中寬葉種與輪葉貝母遺傳距離最小，三籽和多籽與其他浙貝品種 （系）親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而與東貝母的遺傳相似性高于上述5個浙貝母品種 （系），并且皖貝與川貝之間親緣關(guān)系較近，聚為另一類。

貝母；蛋白質(zhì)電泳指紋圖譜；遺傳多樣性；親緣關(guān)系；

中藥貝母為百合科貝母屬多種植物的干燥鱗莖，具有化痰止咳，清熱潤肺之功效。《中國藥典》2010年版將其分為浙貝母Fritillaria thunbergii、川貝母Fritillaria cirrhosa、平貝母Fritillaria ussuriensis、伊貝母Fritillaria pallidiflora、湖北貝母Fritillaria hupehensis5大類。其中，浙貝母是我國傳統(tǒng)的大宗中藥材，被列為 “浙八味”之首，主要來自人工栽培，原產(chǎn)于浙江省寧波市象山縣，目前其栽培基地主要分布于鄞州、縉云、磐安等地，栽培品種 （系）有狹葉、寬葉、三芽 （小三籽）、多芽（多籽種）、輪葉、梅園、新梅園等。而且，浙貝母各產(chǎn)區(qū)的栽培技術(shù)習(xí)慣也不同，許多地方的品種多為自然變異，同時由于長期分散種植，基源植物的種質(zhì)遺傳結(jié)構(gòu)和來源尚不明確［1-2］。本課題組前期采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對磐安產(chǎn)的浙貝母品種進(jìn)行種質(zhì)資源鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相同浙貝母品種的不同個體之間出現(xiàn)了較大的遺傳分化，表明目前該植物種質(zhì)混雜現(xiàn)象比較嚴(yán)重［3］。另外，還比較了金華磐安、寧波章水和江蘇南通5個浙貝母品種的生理生化特性，結(jié)果顯示，產(chǎn)地和品種對浙貝母的多種酶活性和葉綠素含有量均有較明顯影響［4］。藥源植物明確，品系純正是保證藥材道地性的基礎(chǔ)，而浙貝母來源品種的混雜將嚴(yán)重影響其療效和安全性。因此，對該植物種質(zhì)資源的鑒定、種質(zhì)遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系方面的研究工作是指導(dǎo)浙貝母品種選育、GAP標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)以及保證臨床用藥安全穩(wěn)定性的必要理論基礎(chǔ)。

中藥電泳指紋圖譜是將分子生物學(xué)和指紋圖譜的原理應(yīng)用于中藥品種分類、鑒定以及質(zhì)量控制研究的技術(shù)［5］。其中，蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳指紋技術(shù)（Pro-PAGE）是該圖譜中易于規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化的方法，并具有所需樣品量少、實驗時間短、結(jié)果穩(wěn)定性好、重復(fù)性高、技術(shù)簡單、費用低廉等優(yōu)點，在中藥栽培品種資源考察、種內(nèi)遺傳多樣性分析、優(yōu)良品種選育以及藥材采收期判斷等方面［4-5］具有較高的推廣應(yīng)用價值。近年來，人們報道了ISSR［6］、RAPD［7］、AFLP［8］等DNA多態(tài)性技術(shù)以及化學(xué)指紋圖譜技術(shù)［9］用于浙貝母品種內(nèi)或與其他貝母之間遺傳多樣性的分析，然而，采用蛋白電泳指紋圖譜對其多態(tài)性的研究尚未見報道。本實驗采用Pro-PAGE技術(shù)，對浙貝（7個不同栽培品種和品系）和東貝、皖貝、川貝3種近緣藥用種進(jìn)行群體遺傳多樣性分析，為其品種選育及GAP規(guī)范化生產(chǎn)的指導(dǎo)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑及主要儀器 本實驗所有試劑均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。Ge1Doc XR+凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad公司）；高速冷凍離心機（杭州納德科學(xué)儀器公司）；DYY-6C穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀、DYCZ-24EN雙垂直電泳槽（北京市六一儀器廠）。

1.2 樣品采集 本實驗所用的貝母鱗莖分別采自浙江省寧波市鄞州區(qū)章水鎮(zhèn)浙貝母栽培示范基地及金華市磐安縣等地，品種 （系）均經(jīng)浙江萬里學(xué)院王忠華教授鑒定，見表1。

表1 貝母鱗莖的采樣信息及其性狀Tab.1 Sam p le information and characteristics of Fritillaria cultivars

1.3 蛋白質(zhì)提取 將新鮮貝母鱗莖洗凈晾干，取2 g，加入0.1 mo1/L，pH為6.4的磷酸緩沖液（PBS）1 mL，于冰浴中研磨，離心 （12 000 r/min）20 min后取上清液，加入等體積上樣緩沖液（含pH為6.8，1 mo1/L的10%Tris-HC1緩沖液、30%甘油、2%SDS、8%β-巰基乙醇，0.1%溴酚藍(lán)），100℃下煮沸5 min后，4℃下貯藏備用。

1.4 電泳 采用SDS-PAGE法，分離膠和濃縮膠的濃度為別為15%和5%，垂直平板電泳，加樣量為30 μL，電極緩沖液為pH 8.3的Tris-甘氨酸緩沖液（含1‰SDS），起始電壓80 V，在指示劑進(jìn)入分離膠后改為120 V，恒壓電泳6 h，待指示劑 （溴酚蘭）至膠板下沿1 cm左右時停止電泳，小心取出膠板。

1.5 染色及脫色 將膠板浸于考馬斯亮藍(lán)染色液（含0.1%考馬斯亮藍(lán)G250、17%硫酸銨、2.4%磷酸、34%甲醇）中，37℃溫浴下染色過夜后，蒸餾水漂洗3次，再放入脫色液 （含7.5%冰乙酸、10%甲醇、0.5 mo1/L NaC1水溶液），搖床上漂洗4 h，直至譜帶背景清晰。

1.6 指紋圖譜分析 對供試樣品水溶性蛋白電泳帶總數(shù)和多態(tài)性帶數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計，每個樣品電泳遷移率一致位點按無帶或模糊帶記為0，有強帶和弱帶記為1，得到原始數(shù)據(jù)矩陣。然后，用NTSYS 2.10e軟件中的非加權(quán)配對算術(shù)平均法（UPGMA）計算遺傳相似性系數(shù)，并構(gòu)建聚類圖，再用POPGENE 3.2軟件計算等位基因數(shù)（na）、有效等位基因數(shù) （ne）、Shannon多樣性指數(shù) （I）、基因多樣性指數(shù) （H）、總基因多樣度 （Ht）、種內(nèi)基因多樣度 （Hs）、基因分化系數(shù) （Gst），并依據(jù)公式Nm=0.5（1-Gst）/Gst計算基因流（Nm），用于分析種間和種內(nèi)的遺傳變異水平。

2 結(jié)果

2.1 10種貝母的蛋白電泳指紋圖譜 蛋白質(zhì)SDSPAGE譜帶總體上呈現(xiàn)出相似性，共有條帶成像清楚，體現(xiàn)出品種 （系）的一致性，但不同品種（系）間的條帶數(shù)量及其強弱差異也很明顯，能檢測到很豐富的多態(tài)性，也可作為聚類分析的參數(shù)，見圖1。經(jīng)統(tǒng)計，各品種 （系）總蛋白條帶在15～29條之間，30個樣品共得到740條擴增帶，其中多態(tài)性條帶比率為85.71%。

圖1 10種貝母的蛋白質(zhì)SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE spectrogram s of 10 Fritillaria cultivars

2.2 遺傳相似性及多樣性分析 對10種貝母進(jìn)行了遺傳相似性分析，結(jié)果見表2。由表可知，浙貝母的寬葉、輪葉、狹葉、梅園和新梅園5個品種（系）間的相似性較高，相似性系數(shù)在0.772 2～0.933 2之間。其中，寬葉種與輪葉貝母品系間的相似度最高，遺傳距離最小，而浙貝母的另2個品系 （三籽和多籽）與東貝母的遺傳相似性高于上述5個浙貝母品種 （系），并且浙貝、皖貝、東貝、川貝4個種間的相似系數(shù)變化范圍在0.420 0～0.830 3之間，變化幅度較大，表明不同貝母品種間存在較豐富的遺傳多樣性，其中浙貝與川貝的相似性最低，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而皖貝與川貝的相似性最高，親緣關(guān)系較近。

10種貝母的遺傳指數(shù)見表3，可知整體總基因多樣性（Ht）、種內(nèi)遺傳多樣性（Hs）、基因分化系數(shù)（Gst）分別為0.333 4、0.016 2、0.951 4。結(jié)果表明，95.14%的遺傳分化存在于品種 （系）間，而種間基因交流非常有限，僅為0.025 5。

表2 10種貝母間遺傳相似性指數(shù)及遺傳距離Tab.2 Nei's genetic sim ilarity indexes and genetic distances am ong 10 cultivars of Fritillaria

表3 10種貝母遺傳指數(shù)Tab.3 Genetic indexesw ithin 10 cultivars of Fritillaria

2.3 聚類分析 利用NTSYS 2.10e軟件進(jìn)行聚類分析，得到UPGMA系統(tǒng)樹，見圖2。由圖可知，浙貝母7個品種 （系）中的寬葉與輪葉親緣關(guān)系最近，首先聚為一類，再與狹葉、梅園和新梅園3個品種 （系）聚為一支，而三籽和多籽2個浙貝品系的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，與東貝母聚為一支。并且，在不同貝母種之間，皖貝與川貝親緣關(guān)系較近，從地理位置距離來看，原產(chǎn)地相對較近的浙貝和東貝表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系，聚為一大類。

圖2 10個貝母Nei's遺傳距離的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGM A dendrogram of 10 cultivars of Fritillaria based on Nei's genetic distances

3 討論

種質(zhì)資源多態(tài)性及親緣關(guān)系分析對闡明物種的起源、分化、遺傳變異及品種鑒定有著重要意義，可為育種和資源的合理利用提供科學(xué)依據(jù)［10-11］。近年來，用于蛋白質(zhì)或同工酶多態(tài)性檢測的電泳技術(shù)已被廣泛用于品種鑒定［12］及遺傳多樣性分析［13］，由于總蛋白幾乎不受環(huán)境因素的影響，而且多態(tài)性高［14］，已被廣泛用于種質(zhì)資源遺傳多樣性的分析及品種鑒定。

浙貝母繁殖系數(shù)相對較低，其產(chǎn)區(qū)分散，各產(chǎn)區(qū)栽培習(xí)慣也不同，存在許多自然變異的地方栽培品種，其藥源植物的種質(zhì)遺傳結(jié)構(gòu)和來源尚不明確，因此采用分子手段分析浙貝母道地性藥材的種質(zhì)遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性，是指導(dǎo)其品種選育和GAP標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的必要科學(xué)依據(jù)。劉曉賢［6］應(yīng)用ISSR技術(shù)對浙貝母、東貝母、川貝母、安徽貝母等進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有品種間的總遺傳多樣性較高，但浙貝母個別居群基因的多樣性很低。聚類分析顯示，多籽浙貝形成獨立一支，東貝母與浙貝母分化明顯，安徽貝母與川貝母形成一大支不同的貝母品種，表明浙貝母各品種和居群間的基因交流程度非常有限?；赗APD技術(shù)的遺傳多樣性分析［7］顯示，多籽浙貝與狹葉、寬葉和嶺下貝母3個品種 （系）親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，而浙貝母與東貝母的親緣關(guān)系較近，與本實驗的結(jié)論基本一致。而徐金中等［8］應(yīng)用AFLP技術(shù)對具有代表性的6個浙貝母居群進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其居群間的多樣性水平明顯低于居群內(nèi)，同時居群間存在較為明顯的基因交流，推測可能是因為該研究重點考察不同地理位置對浙貝母基因多樣性水平的影響。另外，同一產(chǎn)區(qū)栽培的浙貝母可能有本地種或多個引進(jìn)品種，例如寧波市鄞州區(qū)的浙貝母栽培種有狹葉、寬葉、輪葉、三籽等多個品種 （系），因此同一地理居群內(nèi)豐富的遺傳多樣性有很大一部分可能來源于同居群中不同品種 （系）浙貝母的基因差異。本實驗顯示，浙貝母和東貝母表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系，聚為一大類，而皖貝與川貝之間親緣關(guān)系較近，聚為另一大類；浙貝母7個品種 （系）中的寬葉與輪葉親緣關(guān)系最近，而三籽和多籽2個浙貝品系親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)；10種貝母和7品種（系）浙貝母的總基因多樣性均較高，分別為0.333 4和0.237 9，并且遺傳分化主要存在于種間，各品種 （系）間基因交流非常有限。

綜上所述，貝母的總基因多樣性較高，而且浙貝母各品種 （系）間的形態(tài)和遺傳差異都較為明顯，基因交流也很有限，推測其遺傳分化可能是人為選擇壓力和基因交流障礙引起的。長期的無性繁殖雖然保證了同一品種藥材品質(zhì)的一致性，有利于實施藥材標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，但各品種 （系）間的基因交流非常稀少，不利于優(yōu)良品種的選育。因此，在浙貝母的生產(chǎn)過程中，既要控制不同品種栽培群體的傳播，以避免種質(zhì)混雜，又要盡可能地減少自交衰退所導(dǎo)致的遺傳結(jié)構(gòu)破壞，并注意引進(jìn)優(yōu)質(zhì)種源進(jìn)行雜交育種，以增加后代的雜合度，尤其是三籽、多籽等在遺傳結(jié)構(gòu)上與其它浙貝母品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的品種。

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App lication of protein fingerprints on the genetic relationship am ong Fritillaria species cultivated in different grow ing areas

WU Hao1， PENG Xin1， ZHANG Yu-jiong1， WANG Zhong-hua2*

（1.Zhejiang Pharmaceutical College，Ningbo 315100，China；2.Zhejiang Wanli University，Ningbo 315100，China）

AIMTo study the genetic re1ationship among the various cu1tivars of Fritillaria Linn cu1tivated in Zhejiang Province and other growing areas.METHODSThirty individua1s，inc1uding 7 representationa1cu1tivars of Fritillaria thunbergii，togetherwith F.cirrhosa，F(xiàn).anhuiensis and F.thunbergii var.chekiangensis were investigated by protein fingerprintsmethod.RESULTSItwas revea1ed that0.333 4 was genetic diversity index，0.490 2 was Shannon information index，and 85.71%was percentage of po1ymorphic 1oci（PPB）.CONCLUSIONIt indicates that the simi1arity coefficients among broad-1eaf，whee1-1eaf，narrow-1eaf，Mei-yuan and new Mei-yuan cu1tivars fa11within 0.772 2-0.933 2，especia11y c1oser in genetic distance between broad-1eaf and whee1-1eaf cu1-tivars，whi1e three-seed and severa1-seed cu1tivars have far re1ationsipswith F.thunbergii，butnear to F.thunbergii var.chekiangensis and F.cirrhosa.In addition，the cu1tivars of F.cirrhosa and F.anhuiensis are c1ustered into another group bacause of c1ose genetic re1atioship.

Fritillaria Linn；protein fingerprints；genetic diversity；genetic re1ationship

R282.5

A

1001-1528（2015）08-1757-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.027

2014-09-12

浙江省育種專項項目 （2012C12912）；寧波市農(nóng)業(yè)攻關(guān)重點資助項目 （2012C10036）；浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校校級科研項目（ZPCSR2012010）

吳 浩（1985—），女，實驗師，研究方向為分子生物學(xué)。E-mai1：11wuhao@163.com

*通信作者：王忠華 （1972—），男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為藥用植物分子改良。E-mai1：wang1972@zwu.edu.cn