謝偉杰， 張永萍， 徐 劍， 吳靜瀾， 陳鑫瑀， 魏中旭

（貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽550002）

［制 劑］

正交設(shè)計(jì)聯(lián)用Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)選復(fù)方石斛清肺散提取工藝

謝偉杰， 張永萍*， 徐 劍， 吳靜瀾， 陳鑫瑀， 魏中旭

（貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽550002）

目的采用正交設(shè)計(jì)和Box-Behnken響應(yīng)曲面法優(yōu)選復(fù)方石斛清肺散最佳提取工藝。方法出膏率、橙皮苷含有量為評價(jià)指標(biāo)，通過正交設(shè)計(jì)初步優(yōu)選提取工藝，Box-Behnken效應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化工藝，從可行性和經(jīng)濟(jì)性確定最終提取工藝條件。結(jié)果正交設(shè)計(jì)優(yōu)選的最佳工藝為12倍量50%乙醇，回流提取3次，每次1.5 h；效應(yīng)面法優(yōu)化工藝為14倍量32%乙醇，回流提取3次，每次1.5 h。結(jié)論對比驗(yàn)證試驗(yàn)表明，Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化后提取溶劑用量稍增加，但乙醇體積分?jǐn)?shù)顯著降低，經(jīng)濟(jì)成本將大幅降低。

復(fù)方石斛清肺散；Box-Behnken響應(yīng)曲面法；正交設(shè)計(jì)；橙皮苷；出膏率；提取

清肺散來源于中醫(yī)傳統(tǒng)方，早期記載于 《回春》卷五，由甘草、桑白皮、連翹、川芎、白芷、麥芽、桔梗等11味藥材組成，具有清肺寧嗽化痰之功效，為口服湯劑。研究結(jié)合清肺散處方，依據(jù)現(xiàn)代臨床應(yīng)用和制劑新技術(shù)，加減配伍，形成復(fù)方石斛清肺散，為局部口腔用散劑，能全面調(diào)理或治療咽喉、肺部疾病。但由于其部分藥材纖維含有量高，對咽喉部刺激性較大，故對其中6味藥材進(jìn)行提取，用提取后干燥的浸膏粉投料制備散劑，減小刺激性，減少全粉散劑服用量，提高病患者適應(yīng)性。采用正交設(shè)計(jì)和Box-Behnken效應(yīng)面法［1-3］對藥材提取工藝進(jìn)行研究，為產(chǎn)品生產(chǎn)推廣提供可靠依據(jù)和保證，對中藥現(xiàn)代化發(fā)展具有重要意義。

1 儀器與試藥

Agi1ent1260型高效液相色譜儀 （美國安捷倫公司）；SK8210HP超聲波清洗儀 （上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；AE/240型電子天平 （上海梅特勒儀器有限公司）；DZ-2BC型真空干燥箱 （天津市泰斯特有限公司）。

藥材購買于貴州省貴陽濟(jì)仁堂藥店 （青云路）分店。橙皮苷對照品 （中國食品藥品檢定研究院，批號0721-200010）。甲醇為色譜純；乙醇為分析純；其他實(shí)驗(yàn)用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 定量方法

2.1.1 色譜條件 采用HPLC-工作曲線法定量，色譜柱為Diamonsi1C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為甲醇-水 （38∶62）；VWD檢測器，檢測波長284 nm；柱溫35℃；體積流量1 m L/min；進(jìn)樣體積10μL。

2.1.2 專屬性 供試品溶液制備：取提取液2 m L，用0.45μm微孔濾膜濾過，得供試品溶液。

對照品溶液制備：精密稱量橙皮苷對照品適量，甲醇定容，制成418.33μg/mL的對照品溶液。

陰性樣品溶液制備：取缺橘紅處方藥材提取，取提取液2 m L，用0.45μm微孔濾膜濾過，得陰性樣品溶液。

分別取供試品溶液、對照品溶液、陰性樣品溶液10μL進(jìn)樣，供試品與對照品在相應(yīng)位置均出現(xiàn)目標(biāo)成分色譜峰，而陰性樣品則無，表明此方法專屬性良好，見圖1。

2.1.3 線性考察 精密稱定對照品，分別配制66.93、 100.40、 133.87、 167.33、 200.80、251.00、334.67μg/m L對照品溶液，在上述色譜條件下分別進(jìn)樣10μL，測定峰面積。以峰面積為橫坐標(biāo) （X），質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo) （Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性方程Y=0.053X+2.006，r= 0.999 8（n=7）。結(jié)果表明，橙皮苷在66.93～334.67μg/m L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取橙皮苷對照品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，檢測目標(biāo)成分峰面積，結(jié)果RSD為0.29% （n=6），表明精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品，分別于0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣10μL，測定目標(biāo)峰面積，結(jié)果RSD為1.48% （n=6），表明供試品日內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份1/10處方量藥材，分別制備6份供試品，進(jìn)樣10μL，檢測目標(biāo)峰面積，結(jié)果RSD為2.63% （n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.2 正交設(shè)計(jì)優(yōu)選提取工藝

2.2.1 影響因素與水平 通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定對復(fù)方中6味藥材采用回流提取，制備干浸膏粉?；亓魈崛」に囍饕绊懸蛩赜腥軇?、液料比、提取次數(shù)、提取時(shí)間，各影響因素水平見表1。

表1 正交設(shè)計(jì)影響因素水平Tab.1 Independent variables:factors and levels for orthogonal design

2.2.2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn) 根據(jù)因素水平表，采用L9（34）正交試驗(yàn)，對回流提取工藝初步進(jìn)行優(yōu)選。試驗(yàn)按L9（34）正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行，平行實(shí)驗(yàn)三次，見表2。按1/10處方量稱取以上6味藥材，提取，過濾，得提取液，取2 mL提取液，制備供試品，進(jìn)樣10μL，檢測目標(biāo)成分含有量。另精密吸取定容好的提取液100 mL，稱量該部分總質(zhì)量，再利用恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿于恒溫水浴鍋上揮干，測定出膏率。以出膏率 （%）和橙皮苷含有量 （mg）為評價(jià)指標(biāo)，采用綜合評分法，對試驗(yàn)進(jìn)行分析，綜合評分Y=（出膏率/最高出膏率）×50+（橙皮苷量/最高橙皮苷量） ×50。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and result for L9（34）orthogonal design

2.2.3 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用SPSS 18.0對正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分析結(jié)果見表3、表4。分析結(jié)果表明，模型P＜0.001，說明該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂袠O顯著意義。其中，因素A、C、D具有極顯著性影響，B具有顯著性影響，A因素A2＞A3＞A1，B因素B3＞B2＞B1，C因素C2＞C3＞C1，D因素D3＞D2＞D1。因此，回流提取最佳工藝是A2B3C3D3，即使用12倍量50%乙醇加熱回流提取1.5 h，提取3次。

表3 正交試驗(yàn)的單因素統(tǒng)計(jì)描述Tab.3 General statistics of dependent variab les for orthogonal test results

表4 正交試驗(yàn)方差分析Tab.4 Analysis of variance for orthogonal test results

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 按正交設(shè)計(jì)優(yōu)選的工藝條件，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，測定各指標(biāo)，結(jié)果見表5。參考 《中國藥典》2010年版一部［1］，測得藥材橘紅中橙皮苷含有量為2.06%，以其計(jì)算轉(zhuǎn)移率，進(jìn)一步驗(yàn)證。

表5 正交設(shè)計(jì)最佳工藝條件驗(yàn)證試驗(yàn)Tab.5 Verification tests of optimum conditions in orthogonal design

2.3 Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.3.1 因素水平編碼 根據(jù)正交試驗(yàn)研究基礎(chǔ)，采用Box-Behnken效應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝，主要考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比與提取時(shí)間3個因素。根據(jù)效應(yīng)面法設(shè)計(jì)原理，參考正交試驗(yàn)的水平和結(jié)果，每個因素設(shè)3個水平，用代碼-1、0、1來表示，因素水平與編碼見表6。

表6 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平的編碼Tab.6 Independent variables:factors and levels for Box-Behnken design

2.3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)表，安排各組試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表7。按1/10處方量稱取以上6味藥材，提取次數(shù)暫定為1次，按表7進(jìn)行提取后過濾，得提取液。分別采用HPLC與干燥恒重法檢測橙皮苷含有量和出膏率，采用綜合評分法分析。

表7 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.7 Experimental runs and observed values for Box-Behnken design

2.3.3 模型建立及顯著性檢驗(yàn) 將所得數(shù)據(jù)利用Design-Expert8.0.5軟件，以綜合評分（Y）為效應(yīng)值，利用最小二階乘法對各因素 （自變量）進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式方程擬合，對比各模型擬合參數(shù)。結(jié)果表明，二次多項(xiàng)式回歸模型較優(yōu)，見表8。以ANOVA分析效應(yīng)面回歸參數(shù)，建立響應(yīng)值綜合評分 （Y）對自變量乙醇體積分?jǐn)?shù) （X1）、液料比（X2）和提取時(shí)間 （X3）的二次項(xiàng)回歸模型方程Y= 32.794+0.796X1+3.291X2+17.132X3+0.006 28 X1X2+0.031 4X1X3-0.495X2X3-0.011--（R2=0.963 9，=0.917 5， S/N=15.782＞S/N臨界=4）。

表8 多種模型擬合分析Tab.8 Sequen tialmodel sum of squares for Box-Behnken design

對該模型進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果（見表9）表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間具有極顯著影響，液料比有一定影響，各因素間無顯著性的交互作用，的偏回歸系數(shù)具有顯著性水平。因此，通過方差分析，剔除不顯著項(xiàng)，簡化擬合回歸方程為Y=36.560+0.909X1+ 2.877X2+10.980X3-0.011-（R2=0.954 7，=0.934 1，S/N=22.798＞ S/N臨界=4）。

2.3.4 效應(yīng)面法優(yōu)化工藝 根據(jù)擬合方程，采用Design-Expert軟件，優(yōu)化預(yù)測提取工藝的最佳條件，同時(shí)繪制響應(yīng)值Y隨因素變化的效應(yīng)面圖，具體見圖2。結(jié)果，預(yù)測最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)32%、料液比14∶1，提取時(shí)間4 h，具體見表10。結(jié)合前期基礎(chǔ)研究與實(shí)際生產(chǎn)，將各因素條件進(jìn)行微調(diào)，最終確定復(fù)方石斛清肺散最佳回流提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)32%，料液比14倍，提取時(shí)間1.5 h，提取3次。

表9 二次多項(xiàng)式方程模型方差分析Tab.9 ANOVA for response surface reduced quadratic model

表10 效應(yīng)面法預(yù)測最優(yōu)條件Tab.10 Predicted optim um conditions for Box-Behnken design

2.3.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按效應(yīng)面優(yōu)化后回流提取工藝條件，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，測定各指標(biāo)，結(jié)果見表11。與預(yù)測值對比，各指標(biāo)偏差值較小，說明該試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛢?yōu)化的提取工藝條件能夠較好應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。

表11 效應(yīng)面法最佳工藝條件驗(yàn)證Tab.11 Verification test of optimum conditions for Box-Behnken design

2.4 對比分析 根據(jù)以上正交設(shè)計(jì)和Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)選試驗(yàn)與結(jié)果，對比優(yōu)選的提取工藝參數(shù)和驗(yàn)證結(jié)果，見表12。結(jié)果表明，Box-Behnken效應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化了提取工藝參數(shù)，提高了各個指標(biāo)，并對各指標(biāo)進(jìn)行預(yù)測優(yōu)化，使工藝參數(shù)更加準(zhǔn)確可靠，更符合實(shí)際生產(chǎn)，減少乙醇用量，節(jié)約生產(chǎn)成本。因此，采用效應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果作為該提取工藝最佳條件。

圖2 各因素與響應(yīng)值 （Y）的三維圖Fig.2 Three-dimensional response surface plots of effect of independent factor Y on response values

表12 兩種試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選結(jié)果對比Tab.12 Com parison of results between Box-Behnken design and or thogonal design

3 討論

《神農(nóng)本草經(jīng)》曰 “藥有宜丸者、宜散者、宜水煎煮、宜酒漬者、宜煎膏者，亦有一物兼宜者，亦有不可入湯酒者，并隨藥性，不得違越?！倍嗅t(yī)藥給藥之方式，以湯劑為甚；根據(jù)溶劑極性“相似相溶”理論，選擇水溶性成分橙皮苷作為水煎煮有效成分代表，結(jié)合散劑以干浸膏粉投料，以出膏率為另一只指標(biāo)，綜合兩者研究散劑提取工藝，保證產(chǎn)品質(zhì)量。

Box-Behnken設(shè)計(jì)中，二次項(xiàng)回歸模型擬合P=0.000 3（見表9），說明該模型擬合具有極顯著性意義；模型決定系數(shù)R2=0.963 9（R= 0.981 8），=0.917 5，說明該模型能夠解釋98.18%響應(yīng)值的變化，與實(shí)際試驗(yàn)擬合良好，試驗(yàn)誤差小，響應(yīng)面法優(yōu)化該提取工藝可行，在剔除不顯著項(xiàng)后決定系數(shù)R無明顯變化；模型殘差正態(tài)圖 （見圖3）表明，數(shù)據(jù)分布接近于對角線，殘差的分布接近于正態(tài)分布，該模型和實(shí)際結(jié)果擬合良好。其中失擬誤差項(xiàng)有顯著性影響，說明該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)存在潛在的誤差，而前期研究表明提取次數(shù)對工藝有顯著性影響，此項(xiàng)誤差可能來源于此項(xiàng)、實(shí)驗(yàn)操作及因素水平范圍設(shè)置等，需后期進(jìn)一步研究。

圖3 殘差正態(tài)圖Fig.3 Norm al p lot residuals

正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，是中藥研究常用優(yōu)選方法，但其采用線性模型進(jìn)行分析，結(jié)果代表的是各因素點(diǎn)水平效應(yīng)，難以全面預(yù)測各因素水平間的效應(yīng)變化，存在一定局限。響應(yīng)面優(yōu)化法［4］采用多元線性和二次項(xiàng)模型擬合，分析各因素水平對應(yīng)的響應(yīng)值變化，預(yù)測優(yōu)化各因素水平的趨勢，優(yōu)化工藝參數(shù)，更好優(yōu)選工藝條件，提高中藥制劑產(chǎn)品質(zhì)量。研究先采用完全重復(fù)的L9（34）正交設(shè)計(jì)對該處方中部分藥材提取進(jìn)行優(yōu)選，確定工藝條件；再通過Box-Behnken效應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化，對比結(jié)果 （見表12）也表明響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)能更精確、更細(xì)致地優(yōu)化提取工藝條件，提高中藥制劑質(zhì)量，更可靠、經(jīng)濟(jì)，利于實(shí)際生產(chǎn)。因此，在中藥制劑產(chǎn)品開發(fā)過程［5-15］中，應(yīng)更多采用響應(yīng)面法，提高中藥制劑產(chǎn)品質(zhì)量，推動中藥現(xiàn)代化發(fā)展。

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Extraction optim ization for Com pound Shihu Qingfei Powder by orthogonal design and Box-Behnken design-response surface

XIEWei-jie， ZHANG Yong-ping*， XU Jian， WU Jing-1an， CHEN Xin-yu， WEIZhong-xu

（Guiyang College of Traditional ChineseMedicine，Guiyang 550002，China）

AIMTo estab1ish and optimize the extraction of Compound Shihu QingfeiPowder（CSQP）by the orthogona1design and Box-Behnken design-response surface.METHODSThe extraction of CSQPwas initiated through the orthogona1design，and was then further1y optimized by Box-Behnken design with the hesperidin content and the paste-forming rate assigned as indices.RESULTSThe optimum extraction of orthogona1design was trip1icated 12-fo1d use of50%a1coho1，1.5 h for each time.The optimum extraction of Box-Behnken design was trip1icated 14-fo1d use of32%a1coho1，1.5 h for each time.CONCLUSIONThe extractionmethod by Box-Behnken design takes its economica1advantage，with reference to the extraction by orthogona1design，in terms of a 1ower a1-coho1concentration requirement，in spite of an increased amount of a1coho1 consumption.

Compound Shihu Qingfei Powder（CSQP）；Box-Behnken design；orthogona1design；hesperidin；paste-forming rate；extraction

R284.2

A

1001-1528（2015）08-1683-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.011

2015-01-10

貴州省科技廳項(xiàng)目 （黔科合重G字 ［2012］4001）；貴陽中醫(yī)學(xué)院研究生教育創(chuàng)新項(xiàng)目 （ZYY14024）

謝偉杰（1990—），男，碩士，從事中藥、民族藥新制劑與新劑型研究。Te1：15285134110，E-mai1：xwjginseng@126.com

*通信作者：張永萍，碩士生導(dǎo)師，教授，從事中藥、民族藥新制劑與新劑型開發(fā)研究。Te1：（0851）5652056