萬(wàn)明發(fā) 馮亮 江明友 洪鐘亮

●臨床研究

前列腺素E1對(duì)糖尿病大鼠陰莖海綿體細(xì)胞Bcl-2、Bax表達(dá)的影響

萬(wàn)明發(fā) 馮亮 江明友 洪鐘亮

目的 研究前列腺素E1（PGE1）對(duì)糖尿病大鼠陰莖海綿體細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)的影響并探討其改善勃起功能的機(jī)制。方法 通過(guò)腹腔注射鏈脲佐菌素65mg/kg建立糖尿?。―M）Wistar大鼠模型，然后隨機(jī)分成DM組和DM+PGE1組，DM+PGE1組給予PGE10.2μg/（kg·d）肌肉注射。10周后獲取大鼠陰莖海綿體組織，用原位末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測(cè)陰莖海綿體細(xì)胞凋亡，免疫組化方法檢測(cè)海綿體細(xì)胞中Bcl-2、Bax的表達(dá)。結(jié)果 DM組大鼠陰莖勃起功能明顯低于DM+PGE1組，陰莖海綿體凋亡細(xì)胞數(shù)明顯多于DM+PGE1組，Bax表達(dá)增強(qiáng)，Bcl-2表達(dá)減弱（均P＜0.05）。結(jié)論 PGE1可能通過(guò)下調(diào)Bax和上調(diào)Bcl-2的表達(dá)使DM大鼠陰莖海綿體細(xì)胞凋亡減少，從而改善陰莖勃起功能。

糖尿病 陰莖海綿體 凋亡 Bcl-2 Bax

糖尿?。―M）是由胰島素分泌缺陷和（或）作用缺陷而導(dǎo)致的一種代謝性疾病。勃起功能障礙（ED）指不能獲得或維持勃起以完成令人滿意的性交過(guò)程。ED是DM的常見并發(fā)癥，由DM誘發(fā)的ED稱之為糖尿病性ED（DIED）[1]。

前列腺素E1（PGE1）是一種具有多種生物活性的血管擴(kuò)張劑，具有擴(kuò)張大血管和改善微循環(huán)的雙重作用。通過(guò)陰莖注射PGE1能改善勃起功能，但其治療DIED的機(jī)制以及對(duì)陰莖海綿體細(xì)胞凋亡的影響尚未見于報(bào)道。本研究通過(guò)建立DM大鼠模型，研究PGE1對(duì)陰莖海綿體細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl－2表達(dá)的影響，以期為DIED的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型及分組 純系成年雄性Wistar大鼠50只，購(gòu)于南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物研究所，體重250～300g。每只大鼠進(jìn)入研究前，性功能均正常（由與發(fā)情雌鼠交配證實(shí)）。將大鼠完全隨機(jī)分組為：正常對(duì)照組（NDM組）10只，DM建模組40只。DM建模方法：用0.1mmol/ L的檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液（pH＝4.2）配制新鮮的1%鏈脲佐菌素（STZ）溶液，DM建模組每只大鼠于左下腹腹腔注射STZ 65mg/kg。正常對(duì)照組腹腔注射相應(yīng)劑量的檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液。2周后檢測(cè)血糖，血糖＞16.7mmol/L持續(xù)3d者判定為DM建模成功，共有36只大鼠建模成功。再將DM建模成功的大鼠完全隨機(jī)分成兩組，每組18只，其中DM+PGE1組給予PGE10.2μg/（kg·d）肌肉注射；DM組與NDM組肌肉注射相應(yīng)劑量0.9%氯化鈉注射液。所有大鼠自由飲食，晝夜交替飼養(yǎng)，觀察生活情況。從注射PGE1起共飼養(yǎng)10周，待完成勃起功能檢測(cè)后處死。

1.2 試劑 STZ、阿樸嗎啡（APO）、生物素化抗地高辛抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。PGE1粉針劑（北京泰德制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：200904201，商品名：凱時(shí)，10μg/支），使用前以0.9%氯化鈉注射液稀釋成1mg/L。原位末端標(biāo)記（TUNEL）檢測(cè)試劑盒、Bcl-2和Bax免疫組化試劑盒、鏈霉親合素-生物素-過(guò)氧化物酶（SABC）、蛋白酶K、標(biāo)記緩沖液、3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）、Tris緩沖液（TBS）均購(gòu)于武漢博士德生物工程公司；末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）購(gòu)自美國(guó)Promega公司；地高辛標(biāo)記的dUTP（DIG-dUTP）購(gòu)自德國(guó)BM公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠陰莖勃起功能檢測(cè) 采用Ledda[2]報(bào)道的方法，于飼養(yǎng)結(jié)束后在大鼠頸部皮下注射APO 150μg/ kg，每只大鼠注射后觀察30min，記錄陰莖勃起次數(shù)。以陰莖充血并末端陰莖露出為勃起1次。勃起率為每組中有陰莖勃起的大鼠所占百分比。

1.3.2 大鼠陰莖海綿體細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用TUNEL法，大鼠陰莖組織切片常規(guī)脫蠟水化，經(jīng)3%H2O2處理、蛋白酶K消化，加入TdT和DIG-dUTP后4℃過(guò)夜，封閉后加生物素化抗地高辛抗體并洗滌，SABC、DAB顯色。光鏡觀察凋亡細(xì)胞，胞核中有棕褐色顆粒者為陽(yáng)性。

1.3.3 免疫組化檢測(cè)陰莖海綿體細(xì)胞Bcl-2、Bax的表達(dá) 4μm陰莖組織切片常規(guī)脫蠟水化，一抗為兔抗大鼠Bax或Bcl-2單克隆抗體（1∶150稀釋），二抗為生物素化羊抗兔IgG（1∶100稀釋），以0.01mol/L的PBS（pH=7.4）代替一抗作為陰性對(duì)照，DAB顯色，400倍光鏡下觀察。光鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比，取均值作為該指標(biāo)表達(dá)陽(yáng)性率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用q檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠陰莖勃起功能檢測(cè) 各組大鼠皮下注射APO后都有活動(dòng)增加，毛發(fā)豎立等表現(xiàn)。NDM組勃起次數(shù)（3.52±1.32）次，勃起率100.0%；DM組勃起次數(shù)（1.00±0.00）次，勃起率20.0%；DM+PGE1組勃起次數(shù)（3.10±1.16）次，勃起率61.5%。DM組與NDM組、DM+PGE1組比較，以及DM+PGE1組與NDM組比較，陰莖勃起次數(shù)和勃起率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）。

2.2 各組大鼠陰莖海綿體細(xì)胞凋亡情況比較 DM組中凋亡細(xì)胞最多，而NDM組中較少，DM+PGE1組介于兩者間，3組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。各組大鼠陰莖海綿體細(xì)胞凋亡率比較見表1。光鏡下見海綿體組織中平滑肌細(xì)胞和竇內(nèi)皮細(xì)胞均有凋亡，染色呈黃褐色，核染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮、邊聚、碎裂等，有的還伴隨有細(xì)胞形態(tài)改變，見圖1。

2.3 各組大鼠陰莖海綿體細(xì)胞Bcl-2、Bax表達(dá)陽(yáng)性率比較 DM組和DM+PGE1組大鼠陰莖海綿體細(xì)胞的Bax表達(dá)陽(yáng)性率高于NDM組，Bcl-2表達(dá)陽(yáng)性率低于NDM組；進(jìn)一步比較，DM組Bax表達(dá)高于DM+ PGE1組，Bcl-2表達(dá)則低于DM+PGE1組，組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），見表1及圖2。

表1 各組大鼠陰莖海綿體細(xì)胞凋亡率及Bax、Bcl-2表達(dá)陽(yáng)性率比較（%）

圖1 各組大鼠陰莖海綿體細(xì)胞凋亡情況（A：NDM組；B：DM+PGE1組；C：DM組；TUNEL法染色，×400）

圖2 各組大鼠陰莖海綿體細(xì)胞Bcl-2、Bax表達(dá)情況（A、B、C分別為NDM組、DM組、DM+PGE1組Bax表達(dá)；D、E、F分別為NDM組、DM組、DM+PGE1組Bcl-2表達(dá)；DAB染色，×400）

3 討論

ED是DM最常見也是最容易被忽視的并發(fā)癥，DM的病程長(zhǎng)，血糖控制不良，出現(xiàn)大血管、微血管和神經(jīng)病變等并發(fā)癥都會(huì)導(dǎo)致ED的發(fā)病率增加[3]。DM患者發(fā)生ED的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，一般認(rèn)為與DM所致的周圍神經(jīng)病變使神經(jīng)傳導(dǎo)產(chǎn)生障礙，并引起與陰莖勃起有關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)濃度改變；雄激素的合成和分泌減少；糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）使局部一氧化氮（NO）滅活增加以及產(chǎn)生大量的氧自由基等因素有關(guān)。尤其是體內(nèi)高血糖環(huán)境下氧自由基生成增加，脂質(zhì)過(guò)氧化作用增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡等機(jī)制在ED的發(fā)生過(guò)程中起到了重要作用[4-6]。

PGE1是一種有效的血管活性物質(zhì)，有較強(qiáng)的擴(kuò)張陰莖小動(dòng)脈和松弛陰莖海綿體平滑肌的作用，前者使進(jìn)入海綿體的血液量增加，后者使微小靜脈受壓關(guān)閉進(jìn)而減少血液流出量，從而使陰莖有效勃起。從此原理出發(fā)，目前臨床上應(yīng)用陰莖海綿體注射PGE1治療ED，取得良好的療效。然而筆者觀察到DIED大鼠應(yīng)用PGE1后勃起功能得到明顯改善，PGE1除了通過(guò)直接擴(kuò)張血管發(fā)揮作用之外，是否還通過(guò)其它機(jī)制起到治療ED的作用尚不明確。

近年來(lái)細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控倍受關(guān)注，其中Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用成為研究熱點(diǎn)。Bcl-2是一個(gè)基因家族，可抑制各種原因所致的細(xì)胞凋亡[7]。Bcl-2家族中還包括它的同源蛋白Bcl-xl、Bcl-xs、Bax、Bad等。當(dāng)Bax同源二聚體形成便誘導(dǎo)凋亡，而隨Bcl-2蛋白表達(dá)量上升，越來(lái)越多的Bax二聚體分離，與Bcl-2形成更穩(wěn)定的Bax-Bcl-2異源二聚體，從而抑制了Bax誘導(dǎo)凋亡的作用，即細(xì)胞內(nèi)Bax和Bcl-2的比例調(diào)節(jié)了凋亡的發(fā)生。當(dāng)Bcl-2/Bax比例上調(diào)時(shí)，細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的反應(yīng)性降低，從而抑制細(xì)胞凋亡；當(dāng)Bcl-2/Bax比例下調(diào)時(shí)，細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的反應(yīng)性增強(qiáng)，從而促進(jìn)凋亡發(fā)生。免疫組化染色可以敏感地檢測(cè)到損傷因素作用下的細(xì)胞內(nèi)成分表達(dá)的變化。本研究通過(guò)對(duì)DM大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，DM組大鼠Bax表達(dá)增加及Bcl-2表達(dá)減少與凋亡細(xì)胞數(shù)的增加一致，說(shuō)明Bax和Bcl-2參與了DM大鼠陰莖海綿體細(xì)胞凋亡的調(diào)控。以PGE1干預(yù)后，DM大鼠陰莖海綿體凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著減少，Bax表達(dá)下調(diào)，Bcl-2表達(dá)上升，說(shuō)明PGE1對(duì)減少DM大鼠陰莖海綿體細(xì)胞凋亡有著積極的影響。

總之，Bcl-2和Bax在DM患者陰莖海綿體細(xì)胞凋亡過(guò)程中起重要的作用，而關(guān)于DM情況下陰莖海綿體細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1] Thorve V S,Kshirsagar A D,Vyawahare N S,et al.Diabetes-induced erectile dysfunction:epidemiology,pathophysiology and management[J].J Diabetes Complications,2010,25(2):129-136.

[2] Ledda A.Diabetes,hypertension and erectile dysfunction[J].Curr Med Res Opin,2000,16(suppl 1):S17-S20.

[3]朱選文,李方印,方家杰.他達(dá)拉非治療勃起功能障礙的療效和安全性臨床觀察(附80例報(bào)告)[J].中華男科學(xué)雜志,2006,12(5):421-423.

[4] Ansar M M,Ansari M.Nitric oxide involvement in pancreatic beta cellapoptosis by glibenclamide[J].Nitric Oxide,2006,14(1):39-44.

[5] Lukivskaya O,Patsenker E,Buko V U.Protective effect of ur sodeoxycholic acid on liver mitochondrial function in rats with al loxan-induced diabetes:link with oxidative stress[J].Life Sci,2007, 80(26):2397-2402.

[6] 黎英榮,肖常青,潘海林,等.糖尿病大鼠陰莖組織NOS各亞型表達(dá)及細(xì)胞凋亡的研究[J].中國(guó)糖尿病雜志,2007,15(6):372-373.

[7] Hawkins C J,Vaux D L.Analysis of the role of bcl-2 in apoptosis [J].Immunol Rev,1994,142:127-139.

Effects of PGE1on apoptosis and expression of Bcl-2 and Bax in corpora cavernosal cells of diabetic rats

WAN Mingfa,FENG Liang, JIANG Mingyou,et al.
Department of Urology,the First People's Hospital of Tonglu,Tonglu 311500,China

【 Abstract】 Objective To investigate the effects of PGE1on apoptosis and the expression of Bcl-2 and Bax in corpora cavernosal cells of diabetic rats. Methods Diabetes model was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin in male adult Wistar rats,the animals were randomly divided into DM group(n=18)and DM+PGE1group(n=18).The rats in DM+PGE1group were treated with intravenous injection of 0.2μg/kg PGE1daily for 10 weeks.After 10 weeks,the penis corpora cavernosal tissues were harvested.Cell apoptosis was evaluated by terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling (TUNEL).Immunohistochemistry was employed to detect the expression of Bcl-2 and Bax. Results Compared with rats in group DM,the function of erectile was improved significantly in group DM+PGE1.The number of cell apoptosis was higher,the expression of Bax was stronger and expression of Bcl-2 was weaker in DM group than those in group DM+PGE1. Conclusion PGE1can reduce the apoptosis of penis corpora cavernosal cells in diabetic rats by down-regulating Bax and up-regulating Bcl-2 expression,resulting in the improvement of erectile function.

Diabetes Penis cavernosal tissue Apoptosis Bcl-2 Bax

2014-06-04）

（本文編輯：胥昀）

311500 桐廬縣第一人民醫(yī)院泌尿外科（萬(wàn)明發(fā)、江明友、洪鐘亮）；南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科（馮亮）