劉艷梅 潘印 應(yīng)申鵬 梁勇

HIF-1α和2α基因表達與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的相關(guān)性研究

劉艷梅 潘印 應(yīng)申鵬 梁勇

目的 檢測缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α和2α在甲狀腺乳頭狀癌（PTC）中的表達及其與患者臨床病理特征的相關(guān)性。方法 應(yīng)用免疫組化、Western blot和實時定量RT-PCR技術(shù)檢測30例PTC患者癌組織及30例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織中HIF-1α和2α蛋白及mRNA的表達，并分析其與PTC患者臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果 實時定量RT-PCR結(jié)果顯示PTC組織中HIF-1α和2α的mRNA表達均高于對照組（均P＜0.05），免疫組化結(jié)果顯示PTC組織中HIF-1α和2α的陽性表達率分別為66.67%和76.67%，均明顯高于對照組（均P＜0.01）；Western blot提示PTC組織中HIF-1α和2α蛋白表達量均明顯高于對照組（P＜0.05或0.01）。HIF-1α表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），與其他臨床病理特征均無相關(guān)性，而HIF-2α的表達與患者臨床病理特征均無相關(guān)性（均P＞0.05）。結(jié)論 在PTC組織中，HIF-1α和2α的mRNA及蛋白質(zhì)表達均出現(xiàn)明顯升高，在PTC的發(fā)展過程中可能起促癌作用；且兩者的表達呈同向變化，提示它們可能通過不同機制起著相同或相仿的作用。

HIF-1α HIF-2α 免疫組化 實時定量聚合酶鏈式反應(yīng) Western blot

甲狀腺癌作為最常見的內(nèi)分泌腫瘤，越來越受到重視，美國2013年度新發(fā)病例60 220例，且發(fā)病率逐年遞增[1]。目前全球甲狀腺癌發(fā)病率以平均每年4.00%的速度遞增,已成為備受關(guān)注的惡性腫瘤之一，尤以沿海國家和地區(qū)為高發(fā)，其中以甲狀腺乳頭狀癌（PTC）為主要病理類型[2]。缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）是一組由結(jié)構(gòu)同源的α亞基，以及共同的β亞基組成的異二聚體轉(zhuǎn)錄因子。研究顯示，哺乳動物中存在3種HIF-α亞基（HIF-1α、2α和3α），其中HIF-1α和2α目前研究較多，也較為深入[3-6]。但HIF-1α和2α在PTC中的表達情況，以及兩者對甲狀腺癌發(fā)展的影響，目前尚未見進一步的報道。本研究檢測了甲狀腺癌組織中HIF-1α和2α的表達情況，期望進一步探討在PTC中HIF-1α和2α的表達情況及其臨床意義。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2013年1至6月臺州市中心醫(yī)院腫瘤外科手術(shù)切除的甲狀腺組織標本共60例，其中PTC組織30例為實驗組，患者男11例，女19例，年齡21～72歲，平均48.6歲；對照組為30例隨機選取的結(jié)節(jié)性甲狀腺腫手術(shù)標本中相對正常的組織，患者男14例，女16例，年齡23～72歲，平均45.2歲。標本體積約5mm×5mm～25mm×25mm，其中20mm×20mm以上標本共12例，選取標本中2/3于20 min內(nèi)置于－80℃冰箱中保存，用于實時定量RT－PCR及Western blot檢測；剩下的1/3以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，用于免疫組化檢測。所有病例均經(jīng)病理學(xué)證實，根據(jù)患者年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否伴鈣化、是否合并橋本病、是否侵犯包膜分成7個亞組，其中實驗組中年齡≥45歲18例，＜45歲12例；腫瘤直徑≥2cm的12例，腫瘤直徑＜2cm的18例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例；8例伴鈣化，11例侵犯包膜，6例合并橋本病。

1.2 主要試劑 兔抗人HIF－1α和2α多克隆抗體為Abcam公司產(chǎn)品，免疫組化試劑盒和DAB試劑盒及二抗均購于北京中杉金橋公司。RIPA裂解液、cDNA試劑盒、SYBR Green熒光染料均購于溫州長豐生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實時定量RT－PCR檢測HIF－1α和2α基因表達 設(shè)計HIF－1α、2α基因PCR引物序列，具體為：HIF－1α正向5′－ACT TCT GGA TGC TGG TGA TTT G－3′，反向5′－GCT TCG CTG TGT GTT TTG TTC T－3′；HIF－2α正向5′－TCA TGC GAC TGG CAA TCA GC－3′，反向5′－GTC ACC ACG GCA ATG AAA CC－3′；內(nèi)參GAPDH正向5′－ATG GCC TTC CGT GTC CCC ACT G－3′，反向5′－TGA GTG TGG CAG GGA CTC CCC A－3′，所有引物均由溫州長豐生物科技有限公司合成。取－80℃冰箱保存的標本，冰上操作，提取總RNA并檢測純度，然后轉(zhuǎn)換成cDNA反應(yīng)體系，37℃孵育60min。采用SYBR Green熒光染料，根據(jù)試劑盒使用說明完成40個PCR循環(huán)，收集熒光信號并分析結(jié)果。

1.3.2 免疫組化檢測HIF－1α和2α蛋白表達 所有標本蠟塊行4μm切片，68℃烤片2h，二甲苯浸泡，PBS洗滌后滴加3%H2O2，EDTA緩沖液（pH＝6.0）95℃煮沸抗原修復(fù)，封閉后滴加一抗50～100μl（HIF－1α抗體濃度1∶100、HIF－2α抗體濃度1∶500）4℃過夜，37℃復(fù)溫1h，滴加二抗40～50μl，37℃孵育1h，DAB顯色2min，蘇木精復(fù)染30s，梯度乙醇脫水、透明后封片鏡檢。HIF－1α和2α表達陽性為細胞染色呈棕黃色顆粒，由有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師根據(jù)陽性細胞所占比例及著色強度綜合制定半定量計分標準：（1）陽性細胞計分：＜1%計0分，1%～10%計1分，11%～50%計2分，51%～80%計 3分，＞80%計4分。（2）著色強度計分：弱計1分，中計2分，強計3分。兩個分值相加為最終判定結(jié)果：1分為（－）；2～3分為（+）；4～5分為（++）；6～7分為（+++）。（++）和（+++）認定為陽性。

1.3.3 Western blot檢測HIF－1α和2α蛋白表達 從保存的組織標本中提取蛋白，BCA法檢測測蛋白濃度，上樣檢測，一抗HIF－1α抗體濃度1∶2 500、HIF－2α抗體濃度1∶1 000，化學(xué)發(fā)光試劑顯色，膠片貼近曝光，顯影、定影后檢測蛋白條帶的密度并分析灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，HIF－1α和2α蛋白表達的相關(guān)性及兩者與患者臨床病理特征的相關(guān)性行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 HIF－1α和2α基因在PTC組織中的表達 實時定量RT－PCR提示，目的基因HIF－1α、2α和內(nèi)參基因GAPDH的熔解曲線均為單峰，峰值分別在81.27℃、87.23℃、89.32℃，說明引物的特異性好，擴增曲線效率恒定，都已達到平臺期，可以用該體系對目的基因HIF－1α和2α進行定量分析，見圖1。采用2－ΔΔCt法進行計算，結(jié)果提示HIF－1α和2α的mRNA在PTC及對照組中均有表達，HIF－1α的mRNA在PTC中相對表達量為對照組的1.3899±0.3912，HIF－2α的mRNA的相對表達量為對照組的1.3446±0.0272，比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05）。

2.2 HIF－1α和2α蛋白表達情況

2.2.1 免疫組化檢測HIF－1α和2α蛋白表達 PTC組織中HIF－1α的陽性率為66.67%。對照組中為13.33%，PTC組織中陽性率明顯高于對照組（P＜0.01）；HIF－2α在PTC組織中染色呈強陽性，對照組中染色呈弱陽性或陰性，PTC組織中陽性率為76.67%，明顯高于對照組的10.00%（P＜0.01），見圖2和表1。而且HIF－1α幾乎在胞核、胞質(zhì)均有表達，30例標本中，胞核陽性12例，胞核陽性率為40.00%；而HIF－2α以胞質(zhì)表達為主，30例標本中僅3例胞核陽性，胞核陽性率為10.00%，兩組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（χ2＝7.20，P＜0.05）。

圖1 HIF-1α、2α與GAPDH的熔解曲線及擴增曲線（A：HIF-1α熔解曲線；B：HIF-2α熔解曲線；C：GAPDH熔解曲線；D：HIF-1α擴增曲線；E：HIF-2α擴增曲線；F：GAPDH擴增曲線）

圖2 HIF-1α和2α蛋白在PTC和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織中的表達（A：HIF-1α蛋白在PTC組織中的表達；B：HIF-1α蛋白在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織中的表達；C：HIF-2α蛋白在PTC組織中的表達；D：HIF-2α蛋白在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織中的表達；免疫組化染色，×400）

表1 免疫組化檢測HIF-1α和2α蛋白表達

2.2.2 Western blot檢測 HIF-1α和 2α蛋白表達Western blot提示HIF-1α蛋白在PTC組織中相對表達量為0.6781±0.1061，而在對照組中為0.4680±0.0484，兩組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。HIF-2α蛋白在PTC組織中相對表達量為0.7178±0.0633，而在對照組中為0.5728±0.0867，兩組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），見圖3。

2.3 HIF-1α和2α蛋白表達與PTC患者臨床病理特征的關(guān)系 HIF-1α和2α蛋白表達與PTC患者的性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤內(nèi)鈣化、侵犯包膜及是否合并橋本病均無關(guān)（均P＞0.05）；但HIF-1α與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），而HIF-2α與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否無關(guān)（P＞0.05），見表2。

2.4 PTC組織中HIF-1α和2α蛋白表達的相關(guān)性 30例PTC組織標本中HIF-1α和2α表達均陽性15例，均陰性2例，HIF-1α陽性而HIF-2α陰性8例，HIF-1α陰性而HIF-2α陽性5例，兩者表達無相關(guān)性（rs=-0.056，P＞0.05）。

圖3 Western blot檢測HIF-1α和2α蛋白表達

3 討論

PTC約占甲狀腺癌的80.00%，雖然生長緩慢，預(yù)后較好，但其具有特殊的生物學(xué)行為，容易早期發(fā)生頸部淋巴結(jié)或遠處轉(zhuǎn)移，這往往是導(dǎo)致其不良預(yù)后和患者死亡的主要原因。PTC雖然腫瘤體積較小，但腫瘤發(fā)展過程中極易伴發(fā)鈣化和囊變，這可能與腫瘤細胞所處的低氧微環(huán)境有密切關(guān)系。

表2 HIF-1α、2α蛋白表達與PTC患者臨床病理特征的關(guān)系（例）

HIF是一組由結(jié)構(gòu)同源的α亞基，以及共同的β亞基組成的異二聚體轉(zhuǎn)錄因子。氧濃度主要對α亞基進行調(diào)節(jié)，因此對HIF的研究主要集中在HIF-α。實體腫瘤在發(fā)生、發(fā)展過程中普遍處于低氧微環(huán)境中，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個階段，HIF-1α和HIF-2α通過調(diào)節(jié)不同的靶基因發(fā)揮功能，包括血管生成、細胞增殖、腫瘤干細胞分化等多個方面[4]。Jung等[7]研究顯示，HIF-1α是癌變過程的一個重要轉(zhuǎn)錄因子，IL-1誘導(dǎo)活化核因子-κB/環(huán)氧合酶-2（NF-κB/COX-2）途徑，上調(diào)HIF-1α蛋白的表達，并最終上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達，促進腫瘤血管生成。已有較多研究證實HIF-1α與肺癌[8]、宮頸癌[9]、乳腺癌[10]的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。HIF-2α是1997年由Tian等克隆出的一種含bHLH-PAS域的轉(zhuǎn)錄因子，已有研究證實HIF-1α和2α在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中密不可分，但兩者的作用并不一致，如HIF-2α與肺癌、腎癌關(guān)系密切，在這些腫瘤中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是其他缺氧轉(zhuǎn)錄因子無法取代的[11-12]。

本研究結(jié)果提示在PTC組織中，HIF-1α和2α在基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達方面均明顯高于正常組織。而且兩種蛋白表達與PTC患者的年齡、性別、腫瘤大小、是否伴有鈣化等無明顯相關(guān)性。此外，HIF-1α蛋白表達與淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，而HIF-2α蛋白表達與淋巴轉(zhuǎn)移無關(guān)，此結(jié)果與李娜等[13]對乳腺癌的研究結(jié)果不一致，可能原因與本研究中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性病例數(shù)少有關(guān)，后期需擴大樣本量進一步研究。

本研究中通過免疫組化檢測還發(fā)現(xiàn)，在PTC組織中，HIF-1α在胞核、胞質(zhì)中均有表達，其胞核陽性率達到40.00%，而HIF-2α在胞核中表達量明顯偏低，30例標本中僅有3例在胞核表達。由此可以看出，雖然HIF-2α與HIF-1α的基本氨基酸序列中48.00%相同，bHLH區(qū)有83.00%的相似性，PAS區(qū)有70.00%的相似性，但它們之間仍然存在差異。由此可以假設(shè)，兩者可能存在不同的細胞調(diào)節(jié)機制，HIF-1α的功能發(fā)揮可能更受制于細胞核調(diào)控機制，這可能和分子入核信號及其激活過程有關(guān)。

綜上所述，通過本研究及復(fù)習(xí)相關(guān)文獻可以假設(shè)，PTC組織中的低氧微環(huán)境可能上調(diào)HIF-1α和2α蛋白的表達，并最終使VEGF表達上調(diào)，促進腫瘤血管生成。本研究初步證實兩者表達無相關(guān)性，因此目前筆者只能推斷它們在PTC中通過不同的作用機制發(fā)揮作用，這與Zhu等[14]對口腔癌的研究結(jié)果相仿，但其中的具體分子機制有待進一步研究。

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Expression of hypoxia-inducible factor-1α and 2α in papillary thyroid carcinoma and its association with clinicopathological fea-tures

LIU Yanmei,PAN Yin,YING Shenpeng,et al.
Department of Radiation Oncology,Taizhou Central Hospital,Taizhou 318000, China

【 Abstract】 Objective To investigate the expression of hypoxia-inducible factor-1α and 2α (HIF-1α and HIF-2α) in papillary thyroid carcinoma(PTC)and its association with clinicopathological features. Methods The expression of HIF-1α and HIF-2α proteins and mRNAs was detected by immunohistochemistry,Western blot and RT-PCR in 30 cases of papillary thyroid carcinoma(PTC group)and 30 cases of nodular goiter tissue(control group),respectively.The correlation of HIF-1α and HIF-2α expression with clinicopathological features of PTC was analyzed. Results RT-PCR showed that expression of HIF-1α and HIF-2α mRNA in PTC group was significantly higher than that in control group(P＜0.05).Immunohistochemistry showed that the positive expression rates of HIF-1α and HIF-2α were 66.67%and 76.67%in PTC group,which was significantly higher than those in control group(P＜0.01);and Western blot results showed the same conclusions.The expression of HIF-1α and HIF-2α was not correlated with the clinicopathological features of PTC,except for HIF-1α with lymphatic metastasis. Conclusion The expression of HIF-1α and HIF-2αis up-graduated in papillary thyroid carcinoma,but the expression is not correlated with the clinicopathological features of the cancer.

HIF-1α HIF-2α Immunohistochemistry RT-PCR Western blot

2014-11-19）

（本文編輯：胥昀）

白細胞介素（IL）變異系數(shù)（CV）丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）丙型肝炎病毒（HCV）磁共振成像（MRI）蛋白質(zhì)印跡（Western blot）低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）動脈血氧二氧化碳分壓（PaCO2）動脈血氧分壓（PaO2）輔助性T淋巴細胞（Th）干擾素（IFN）甘油三酯（TG）高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）核因子-κ（NF-κB）紅細胞沉降率（ESR）活化部分凝血活酶時間（APTT）獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）甲型肝炎病毒（HAV）接受者操作特征曲線（ROC曲線）精制結(jié)核菌素試驗（PPD）磷酸鹽緩沖液（PBS）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）凝血酶時間（TT）凝血酶原時間（PT）曲線下面積（AUC）人類免疫缺陷病毒（HIV）腎小球濾過率（GFR）食品藥品管理局（FDA）世界衛(wèi)生組織（WHO）隨機對照試驗（RCT）胎牛血清（FBS）體重指數(shù)（BMI）天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）纖維蛋白原（Fb）血管性血友病因子（vWF）血紅蛋白（Hb）嚴重急性呼吸綜合征（SARS）乙型肝炎病毒（HBV）乙型肝炎病毒表面抗體（抗-HBs）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）乙型肝炎病毒e抗體（抗-HBe）乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）乙型肝炎病毒核心抗體（抗-HBc）直接膽紅素（DBil）腫瘤壞死因子（TNF）重癥監(jiān)護病房（ICU）自然殺傷細胞（NK細胞）總膽固醇（TC）總膽紅素（TBil）最小抑菌濃度（MIC）

318000 臺州市中心醫(yī)院放療科（劉艷梅、潘印、應(yīng)申鵬）；溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科（梁勇）

梁勇，E-mail：liangytu@aliyun.com