鐘萬(wàn)鍔 張海峰 周國(guó)雄

●基礎(chǔ)研究

5-脂氧合酶在小鼠惡唑酮潰瘍性結(jié)腸炎中的表達(dá)研究

鐘萬(wàn)鍔 張海峰 周國(guó)雄

目的 研究5-脂氧合酶（5-LOX）在惡唑酮誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎（UC）小鼠結(jié)腸黏膜中的表達(dá)情況，探討其在UC發(fā)病機(jī)制中的作用及其與炎癥程度的關(guān)系。方法 50只Balb/c小鼠分為正常對(duì)照組10只和模型組40只。模型組用3%惡唑酮致敏2d，第5天用0.5%惡唑酮灌腸。第8天用頸椎脫臼法處死所有小鼠。實(shí)驗(yàn)期間觀察小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI），處死小鼠后行結(jié)腸組織學(xué)病理評(píng)分（HPS）。RT-PCR法檢測(cè)結(jié)腸黏膜5-LOXm RNA的表達(dá)，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)結(jié)腸黏膜5-LOX的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果模型組DAI和HPS均高于對(duì)照組，5-LOXm RNA和蛋白表達(dá)也明顯高于對(duì)照組（均P＜0.01），并隨炎癥程度加重，表達(dá)水平明顯增高。結(jié)論 5-LOX在UC中表達(dá)水平明顯升高，并參與了UC的發(fā)生和發(fā)展，在一定程度上可反應(yīng)疾病的活動(dòng)度，并且可能作為藥物治療的潛在靶點(diǎn)。

潰瘍性結(jié)腸炎 5-脂氧合酶 RT-PCR免疫組織化學(xué)

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因、發(fā)病機(jī)制未明的反復(fù)發(fā)作的慢性非特異性腸道炎癥。目前認(rèn)為其發(fā)病可能與免疫、遺傳、感染及精神等多種因素相互作用有關(guān)，免疫學(xué)因素是UC研究的熱點(diǎn)之一?；ㄉ南┧幔ˋA）是人體的一種必需脂肪酸，參與UC炎癥發(fā)生、發(fā)展的整個(gè)過(guò)程。AA主要通過(guò)環(huán)氧合酶（COX）和脂氧合酶（LOX）兩條途徑代謝。5-脂氧合酶（5-LOX）是AA的LOX代謝途徑的關(guān)鍵酶，可催化AA生成白三烯B4（LTB4）。LTB4與炎癥細(xì)胞上的LTB4受體相互作用，介導(dǎo)對(duì)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向炎癥部位趨化，LTB4被認(rèn)為是UC中起主要作用的炎性介質(zhì)[1]。小鼠惡唑酮結(jié)腸炎模型是一種Th2型結(jié)腸炎模型，組織學(xué)表現(xiàn)與人類UC相似[2]。本研究以惡唑酮誘導(dǎo)小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模擬人類UC，評(píng)估結(jié)腸炎癥程度，通過(guò)RT-PCR和免疫組織化學(xué)的方法研究5-LOX在惡唑酮誘導(dǎo)小鼠UC中的表達(dá)情況，探討5-LOX在UC發(fā)病中的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雌性Balb/c小鼠50只，4～6周齡，體重16～22g，由南通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)于南通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心屏障環(huán)境。稱重、編號(hào)后隨機(jī)分為正常對(duì)照組和模型組。正常對(duì)照組10只，無(wú)需特殊處理。模型組40只，參照Heller等[3]所用方法建立惡唑酮小鼠結(jié)腸炎模型。惡唑酮購(gòu)于Sigma公司，小鼠背部皮膚剃毛（2cm×2cm），皮膚滴注3%惡唑酮（溶解于100%乙醇中）0.2ml，自然風(fēng)干。1d后重復(fù)滴注1次；5d后將直徑2mm的硅膠管經(jīng)肛門插入腸道深約3cm，注入0.5%惡唑酮（溶解于50%乙醇中）0.15ml，注入后將小鼠倒置30s以防止回流。第8天用頸椎脫臼法處死所有小鼠。采集小鼠結(jié)腸標(biāo)本備檢。根據(jù)疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）和結(jié)腸組織學(xué)病理評(píng)分（HPS）分為輕度炎癥組5只、中度炎癥組18只和重度炎癥組17只。

1.2 結(jié)腸炎癥評(píng)詁 造模過(guò)程中每日觀察小鼠體重變化、大便性狀、便血等情況。參照Murano等[4]所列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行DAI評(píng)分，DAI=（體重下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù)）/3。處死小鼠后取病變明顯處，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，觀察組織學(xué)改變，參照Wirtz等[5]所列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行HPS評(píng)分。

1.3 RT－PCR法測(cè)定5－LOX 提取總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，取5μl cDNA用于PCR擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參照。GAPDH、5－LOX引物由上海生工生物科技公司設(shè)計(jì)并合成。5－LOX上游序列：5′TATCGATGGATGGATGGAGTGGAA3′，5－LOX下游序列：5′GACTGGAACATGTGCATGAAG3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為198bp。GAPDH上游序列：5′CCTCAAGATCATCAGCAAT3′，GAPDH下游序列：5′CCATCCACAGTCTTCTGGGT3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為241bp。循環(huán)參數(shù)如下，5－LOX：94℃變性20s，56℃退火20s，72℃延伸30s，循環(huán)45次，80℃延伸20s。GAPDH：94℃變性20s，56℃退火20 s，72℃延伸30s，循環(huán)45次，80℃延伸20s。擴(kuò)增后取PCR產(chǎn)物作1.5%瓊脂糖凝膠電泳。用凝膠分析系統(tǒng)對(duì)條帶作半定量分析，讀取其積分光密度（IOD）值，以5－LOX平均IOD值/GAPDH平均IOD值來(lái)表示5－LOX相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。

1.4 免疫組化方法測(cè)定5－LOX蛋白 采用Elivison二步法進(jìn)行染色。加5－LOX（Caymana Chemical公司，工作濃度15μg/ml）作為一抗，每張切片加兔抗羊二抗（Jackson公司，工作濃度1∶500）。采用定量積分法，每張切片至少觀察5個(gè)高倍視野100個(gè)細(xì)胞，對(duì)每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞比例及陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度分別進(jìn)行計(jì)分，以胞核或胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)棕黃色或褐色顆粒狀物者為陽(yáng)性細(xì)胞，陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)棕黃色反應(yīng)產(chǎn)物。采用以下染色積分評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[6]：染色強(qiáng)度分為4級(jí)，即陰性染色（0分），弱陽(yáng)性染色（1分），中度陽(yáng)性染色（2分），強(qiáng)陽(yáng)性染色（3分）；每張切片按所見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞范圍分為5級(jí)，即陰性為0分，陽(yáng)性細(xì)胞占1%～25%為1分，陽(yáng)性細(xì)胞占26%～50%為2分，陽(yáng)性細(xì)胞占51%～75%為3分，陽(yáng)性細(xì)胞占76%～100%為4分。每張切片的染色積分以染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞比例乘積之和表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用STATA 12.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或方差分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠發(fā)病情況及DAI評(píng)分比較 對(duì)照組小鼠飲食、活動(dòng)及大便性狀正常，體重略有增加。模型組小鼠造模后第1天開(kāi)始出現(xiàn)食量和活動(dòng)減少，大便表現(xiàn)為稀便或半稀便，體重減輕；第3天開(kāi)始出現(xiàn)便血或大便隱血（+～++）；體重減輕更加明顯。與對(duì)照組相比，模型組DAI明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)表1。

2.2 兩組小鼠組織學(xué)觀察及HPS評(píng)分比較 對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜光鏡下無(wú)組織損傷表現(xiàn)（圖1）。模型組小鼠結(jié)腸黏膜不同程度水腫、出血、糜爛及潰瘍形成，固有層腺體變形、排列紊亂，黏膜及黏膜下層可見(jiàn)密集分布的淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，偶見(jiàn)淋巴濾泡形成（圖2）。與對(duì)照組相比，模型組HPS明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)表1。

表1 兩組DAI和HPS評(píng)分比較

圖1 對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜光鏡下所見(jiàn)（HE染色，×100）

圖2 模型組小鼠結(jié)腸黏膜光鏡下所見(jiàn)（HE染色，×100）

2.3 兩組小鼠5－LOXmRNA表達(dá)水平比較 模型組小鼠5－LOXmRNA表達(dá)上調(diào)，對(duì)照組5－LOXmRNA僅微弱表達(dá)（圖3），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)表2。

2.4 兩組小鼠免疫組化染色積分比較 在對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜組織中，5－LOX無(wú)或僅有弱陽(yáng)性表達(dá)（圖4），模型組與對(duì)照組比較，5－LOX表達(dá)顯著增高（圖5），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），詳見(jiàn)表2。

表2 兩組小鼠5-LOXmRNA表達(dá)水平、免疫組化染色積分比較

圖3 兩組小鼠5-LOXmRNA表達(dá)電泳圖

圖4 對(duì)照組小鼠結(jié)腸標(biāo)本5-LOX表達(dá)（免疫組化染色，× 400）

圖5 模型組小鼠結(jié)腸標(biāo)本5-LOX表達(dá)（免疫組化染色，× 400）

3 討論

UC的病因及發(fā)病機(jī)制至今仍不清楚，多數(shù)研究認(rèn)為與免疫反應(yīng)異常有關(guān)，尤其與腸黏膜局部免疫反應(yīng)的異常關(guān)系密切，細(xì)胞因子在UC的發(fā)病中起著多重作用。腸道免疫系統(tǒng)存在著一種微妙的平衡，促炎因子與抗炎因子通過(guò)精細(xì)的調(diào)節(jié)維持宿主腸黏膜的防御能力，使腸組織免遭破壞，但這種平衡一旦打破，非特異性剌激和活化的炎癥細(xì)胞均可產(chǎn)生并釋放大量破壞性的免疫分子及炎癥因子。各種細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)的相互作用形成復(fù)雜的甚至有自身放大作用的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腸黏膜損傷，從而參與UC的發(fā)生、發(fā)展[7]。

我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在惡唑酮誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中，5-LOX表達(dá)上調(diào)，炎癥越重，5-LOX表達(dá)越強(qiáng)，而對(duì)照組小鼠5-LOX不表達(dá)或弱陽(yáng)性表達(dá)。5-LOX是機(jī)體生成白三烯B4（LTB4）的關(guān)鍵酶，相對(duì)分子量為78kD，普遍存在于哺乳動(dòng)物的各種組織和血液細(xì)胞中，主要見(jiàn)于白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞，細(xì)胞不同的狀態(tài)可能有不同的5-LOX亞細(xì)胞定位[8]。5-LOX主要作用于炎癥的后期，可以調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的遷移浸潤(rùn)能力，促進(jìn)黏附分子的表達(dá)和炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，增加腸黏膜滲透性，在UC組織損傷和炎癥產(chǎn)生過(guò)程中具有重要的作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠結(jié)腸炎模型腸黏膜中5-LOX表達(dá)水平增高，應(yīng)用5-LOX抑制劑可減輕大鼠結(jié)腸的炎癥表現(xiàn)[10-12]。Mazzon等[13]觀察5-LOX基因敲除的結(jié)腸炎模型小鼠，發(fā)現(xiàn)其腹瀉和結(jié)腸炎癥程度明顯減輕，提示5-LOX與UC密切相關(guān)，5-LOX抑制劑可能對(duì)UC具有潛在的治療價(jià)值。

因此，我們認(rèn)為，5-LOX參與了UC的發(fā)生和發(fā)展，5-LOX通過(guò)催化花生四烯酸（AA）生成LTB4。LTB4與炎癥細(xì)胞上的LTB4受體相互作用，介導(dǎo)對(duì)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向炎癥部位趨化，最終導(dǎo)致腸道黏膜炎癥的發(fā)生。由此可見(jiàn)，5-LOX在UC發(fā)病中起了重要作用，可能成為潛在治療的靶點(diǎn)。目前5-LOX在UC中的具體作用還不完全清楚，因此，進(jìn)一步研究它們的作用機(jī)制有著重要意義。

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Expression of 5-lipoxygenase mRNA and protein in colon mucosa of mice w ith oxazolone-induced ulcerative colitis

ZHONG Wane, ZHANG Haifeng，ZHOU Guoxiong.
Department of Gastroenterology,Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong 226001, China

Objective To investigate the exp ression of 5-lipoxygenase(5-LOX)m RNA in colon mucosa in m ice w ith oxazolone-induced ulcerative colitis(UC).Methods Fifty female Balb/c m ice were divided into controlg roup(n=10)and UC g roup(n=40).Mice in UC g roup received subcutaneous injection of3%(w/v)oxazolone for 2d and subsequently received enema w ith 0.5%(w/v)oxazolone on d5 after sensitization.On d7 the m ice were sac rificed for harvestof colon sam p les;disease ac tivity index(DAI)and histopathologicalscore(HPS)were also evaluated.The exp ression of5-LOXm RNA and p rotein in colonmucosa were detected by RT-PCR and immunohistochem istry,respectively.Results The DAIand HPS were higher in UC g roup than those in controlgroup.The exp ression of5-LOXmRNA and p rotein were significantly increased in UC m ice com pared to controls (P＜0.01),and the exp ression was positively correlated w ith the severity of colonic inflammation.Conclusion The exp ression of 5-LOX is up-regulated in colon mucosa ofm ice w ith oxazolone-induced ulcerative colitis,which ind icates that 5-LOXmay be involved in the developmentofUC and 5-LOXm ightbe a potentialpharmacological target for treatmentofUC.

Ulcerative colitis 5-LOX RT-PCR Immunohistochem istry

2013-12-16）

（本文編輯：沈叔洪）

226001南通,南通大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(鐘萬(wàn)鍔現(xiàn)在寧波市第六醫(yī)院消化內(nèi)科工作)

周國(guó)雄,E-mail：zhouguoxiong@medmail.com.cn