梁鈺龍 徐花女 洪紅華 崔順安

●臨床研究

口腔脫落細胞檢測無精子因子微缺失的臨床應(yīng)用

梁鈺龍 徐花女 洪紅華 崔順安

目的 探討同一個體口腔脫落細胞和血液檢測無精子因子（AZF）缺失的相關(guān)性，研究口腔脫落細胞檢測AZF的可行性。方法 選擇287例研究對象，其中嚴重少弱精癥120例，無精癥80例，正常男性87例。同一受試對象的血液和口腔脫落細胞樣本統(tǒng)一編號。應(yīng)用多重PCR技術(shù)，分別檢測口腔脫落細胞、血液基因組中AZF區(qū)域的Y染色體微缺失情況。結(jié)果 血液和口腔脫落細胞檢出AZF缺失的樣本編號一一對應(yīng)，并且缺失類型一致。在200例患者中，29例檢出基因組AZF基因微缺失，余171例患者和87例正常對照者未檢出AZF基因微缺失。結(jié)論 在進行Y染色體微缺失篩查中，口腔脫落細胞檢測AZF簡便、無創(chuàng)，可以替代血液AZF檢測。

Y染色體微缺失 不育癥 口腔脫落細胞 基因診斷

不育癥的患病率正在逐年上升，1年以上有規(guī)律性生活不能懷孕的夫婦約占所有新婚夫婦的15%，男性不育因素占50%左右[1]。目前約有30%的不育癥病因無法解釋，有研究發(fā)現(xiàn)Y染色體微缺失，特別是無精子因子（azoospermia factor，AZF）基因微缺失，與男性生精功能有關(guān)。據(jù)報道，約有15%的原發(fā)生精障礙患者由Y染色體AZF微缺失所引起[2]。目前作AZF基因檢測時，通常采用血液提取DNA樣本，而采用口腔脫落細胞的報道較少[3]。采取血液樣本屬有創(chuàng)檢測，且處理比較復(fù)雜，無法大規(guī)模應(yīng)用于不育癥患者的AZF微缺失篩查及AZF微缺失家系調(diào)查。本研究通過檢測口腔脫落細胞和血液基因組AZF并進行比較，探討口腔脫落細胞檢測AZF的可行性和準(zhǔn)確性，旨在找到一種簡便、無創(chuàng)、準(zhǔn)確的檢測方法，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取本院泌尿科和不孕不育門診2011年1月至2013年12月就診的287例男性受檢者為研究對象，其中嚴重少弱精癥120例、無精子癥80例，平均年齡（28.0±0.5）歲；另87例為有生育能力的正常男性（正常對照組），平均年齡（27.4±0.6）歲；其精子密度＞20× 106/ml，快速前向運動和前向運動精子比率＞60%，睪丸體積、核型分析未見異常。嚴重少弱精癥、無精子癥診斷標(biāo)準(zhǔn)按照1999版《WHO人類精液及精子-宮頸黏液互相作用實驗室檢驗手冊》，檢測前抽靜脈血檢查染色體核型（G顯帶技術(shù)）、抗精子抗體（ELISA法）及血清激素水平（卵泡刺激素、黃體生成素、睪酮，放射免疫測定法），異常者不列入研究。并擇11例正常女性為陰性對照。

1.2 儀器和材料 H.Q＆.Q.血液DNA提取試劑盒（安徽優(yōu)晶生物工程有限公司），往復(fù)式水浴恒溫振蕩器（SHZ-88A，太倉市實驗設(shè)備廠），臺式小離心儀，1.5ml小離心管，無水乙醇（每個樣品大約0.3ml），異丙醇（每個樣品大約0.3ml），EB液，PCR體系，電泳儀，凝膠成像儀，PCR儀。

1.3 檢測方法 每例受檢者于清晨用EDTA或ACD抗凝管取外周血3ml；同一個體取純凈水15ml，用力漱口30s后用吸管緩慢注入一次性廣口無菌杯，搖勻，取1m l注入1.5m l EP管，均放入－20℃冰箱保存。每例受檢者統(tǒng)一編號，血液樣本加注B（blood），漱口液樣本加注O（oral）。

血液樣本按照歐洲男科協(xié)會（EAA）和歐洲分子遺傳質(zhì)控協(xié)會（EMQN）2004版標(biāo)準(zhǔn)進行檢測，選取Y染色體常見的微缺失位點STS位點（sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、sY255）進行PCR擴增檢測，同時選取男性性別決定基因SRY作為內(nèi)對照，女性作為陰性對照，水作為空白對照。合成的 SRY、sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、sY255等引物序列見表1。

表1 引物序列

漱口液樣本從冰箱取出解凍，離心后計數(shù)，每份含口腔脫落細胞（1.4±0.2）×105個。口腔脫落細胞樣本和血液樣本按均按以下步驟進行實驗：1.5ml EP管加OB蛋白酶25μl，加xy緩沖液250μl，加樣本250μl，上下顛倒混勻，水浴70°C 20min，顛倒混勻1次，加無水乙醇260μl，顛倒混勻，標(biāo)本轉(zhuǎn)移至含硅膠柱收集管，離心13 000r/min，2min，棄收集管及流出液，用一新收集管，加DNA洗滌緩沖液710μl，離心13 000r/min，2min，棄收集管及流出液，再重復(fù)3次。硅膠柱轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管，加DNA洗脫緩沖液25μl，離心13 000r/min，2min，棄硅膠柱。取上述1.5ml EP管中液（含DNA樣本模版）2μl，加入PCR體系20μl，加入引物9μl，放入PCR儀，94°C 2.5min，95°C 0.5min，59°C 0.5min，72°C 0.5min，35個循環(huán)，72°C 5min。取PCR液0.3μl，3%agrose（加入），加EB液2滴，120 V 20min，放入凝膠成像儀，瓊脂糖電泳觀測結(jié)果并攝片。

2 結(jié)果

200例患者和87例正常對照男性的口腔脫落細胞、血液標(biāo)本均提取出了基因組DNA，經(jīng)多重PCR擴增、電泳，顯示出特異性SRY（472bp，Y染色體性別決定區(qū)）帶，提示PCR擴增反應(yīng)有效，提取的DNA具有完整性。經(jīng)檢查和核對，200例患者中29例檢出基因組AZF基因微缺失，檢出AZF缺失的樣本，編號完全一致，并且缺失類型一致，其余171例患者和87例正常對照基因組未檢出AZF基因微缺失?？谇幻撀浼毎蚪M與外周血液基因組兩者電泳圖像不僅結(jié)果完全一致，而且圖像質(zhì)量同樣清晰，見圖1、2。

3 討論

目前口腔脫落細胞檢測已在法醫(yī)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，但在臨床診斷方面應(yīng)用較少。對不育男性進行AZF檢測時是否可以利用口腔脫落細胞，值得探索和研究。本研究結(jié)果表明，在進行Y染色體微缺失篩查中，利用口腔脫落細胞檢測AZF簡便、無創(chuàng)、準(zhǔn)確，完全可以替代血液檢測。

Y染色體基因微缺失與男性精子發(fā)生相關(guān)，其原因在于Y染色體存在性別決定基因和精子發(fā)生相關(guān)基因。Y染色體有大量重復(fù)序列（如回文結(jié)構(gòu)），與精子的發(fā)生、Y染色體本身結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定等有密切關(guān)系。由于Y染色體本身結(jié)構(gòu)的特點，在生殖細胞分裂過程中，其長臂基因序列易發(fā)生微缺失，導(dǎo)致男性不育癥[4]。AZF位于Y染色體長臂的1區(qū)1帶，它被分為3個相互獨立的區(qū)域：AZFa、AZFb和AZFc[5]。其中AZFc微缺失最為常見[6]，可表現(xiàn)為唯支持細胞綜合征（SCOS）、精子成熟停滯、精子生成低下等。Y染色體微缺失檢測具有現(xiàn)實意義：（1）不同的位點缺失或者是否存在缺失其治療方法不同。檢測結(jié)果可指導(dǎo)醫(yī)生是否采用卵細胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)（ICSI）輔助生育。AZFa、AZFb、AZFb+c、AZFa+b+c。這4種類型缺失的患者，一般表現(xiàn)為無精子癥，即使通過睪丸穿刺，獲得精子的概率也幾乎為零，故不建議進行穿刺手術(shù)和施行ICSI，可以通過人類精子庫供精生育后代。AZFc區(qū)域缺失的少精子癥患者，其精子數(shù)目有進行性下降的趨勢，部分患者最后發(fā)展為無精子，所以應(yīng)及早進行治療，對暫不需要后代的患者，可將其精液冷凍保存。（2）指導(dǎo)生育。Y染色體微缺失檢測為是否選擇性移植女性胚胎提供依據(jù)，由于男性后代將遺傳父親的不育缺陷[7]，因此患者檢測到Y(jié)染色體微缺失，即使給予ICSI治療，對于不育癥男性而言，其男性后代仍有可能被遺傳Y染色體微缺失，成為又一例不育患者[8]。對于不孕癥男性患者有必要進行細胞DNA檢測，以明確是否攜帶有Y染色體微缺失，從而幫助不育夫婦決定是否進行ICSI治療或決定是否生育男性后代。

圖1 口腔脫落細胞基因組電泳圖（M：分子量參照標(biāo)準(zhǔn)；N：正常男性；1、2：AZFa缺失；3、4：AZFb缺失；5、6：AZFc缺失；7、8：AZFa+b+c缺失；9、10：AZFb+c缺失；11、12：女性；13、14：水；SRY：Y染色體性別決定區(qū)基因）

圖2 血液細胞基因組電泳圖（M：分子量參照標(biāo)準(zhǔn)；N：正常男性；1、2：AZFa缺失；3、4：AZFb缺失；5、6：AZFc缺失；7、8：AZFa+b+c缺失；9、10：AZFb+c缺失；11、12：女性；13、14：水；SRY：Y染色體性別決定區(qū)基因）

目前提取DNA的方法有多種，最常用的是采外周血液，而采用口腔脫落細胞研究比較少。本研究針對Y染色體微缺失最多見的AZF 6個基因位點，對200例患者和87例正常男性，分成外周血液、口腔脫落細胞基因兩組進行檢測，發(fā)現(xiàn)同一個體其口腔脫落細胞與外周血基因組Y染色體6個特異性序列標(biāo)簽位點的缺失或存在是一致的，圖像同樣清晰準(zhǔn)確，證實口腔脫落細胞完全可以替代血液進行AZF檢測，而且采用口腔脫落細胞簡便、無創(chuàng)，有助于不育癥患者AZF大規(guī)模篩查和AZF缺失的家系調(diào)查。但口腔脫落細胞畢竟來源于外胚層，而非胚細胞系，研究結(jié)果并不能直接顯示胚細胞的Y染色體微缺失情況。口腔脫落細胞與外周血細胞基因組DNA表達是否一致，是否有嵌合體的形式，這方面報道甚少，有待進一步研究。

致謝：本研究工作部分在上海仁濟醫(yī)院人類精子庫實驗室完成，并得到李錚主任、朱子玨博士后無私的幫助和指導(dǎo)，特此表示衷心的感謝！

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Detection of microdeletions in azoospermia factor(AZF)from oral exfoliated cells

LIANG Yulong,XU Huanv,HONG Honghua,et al.
Department of Andrology，Changxing Maternity and Child Health Care Hospital,Changxing 313100,China

Objective To evaluate the app lication of oral exfoliated cell samp les in detec tion of m ic rodeletions in azoosperm ia factor(AZF).Methods Blood sam p le and oral exfoliated cells were collected from 120 patients w ith severe oligosperm ia,80 patients w ith azoosperm ia,and 87 normalmales as control.Multi-PCR technique was app lied to detect the Y chromosomem ic rodeletions in AZF region in oralexfoliated cells and b lood cells genome.The results ofb lood cells and oralexfoliated cells from same sub jects were compared.Results AZFm icrodeletion was detected in 29 patients,while the rest 171 patients and 87 normalmale had negative results;the results from oralexfoliated cells were all consistentw ith those from b lood cells.Conclusion Oralexfoliated cellsamp les can be used for Y chromosomem ic rodeletions screening,which is comparab le to b lood cellsamp les.

Y chromosomem icrodeletions Infertility Oralexfoliated Genetic diagnosis

2013-12-09）

（本文編輯：沈叔洪）

湖州市市級科技項目（2012YS23）

313100長興縣婦幼保健院男性科（粱鈺龍），婦產(chǎn)科（徐花女、洪紅華），實驗室（崔順安）

梁鈺龍，E-mail：cxfbyszjkk@163.com