鄭海紅 甘梅富 翁壽向 徐鋮 葛震

扶正活血中藥治療放射性肺損傷的實(shí)驗(yàn)研究

鄭海紅 甘梅富 翁壽向 徐鋮 葛震

目的 觀察放射性肺損傷大鼠肺組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）表達(dá)水平及肺組織病理學(xué)特征，探討扶正活血中藥對放射性肺損傷的防治作用及可能機(jī)制。方法 將56只SD雌性大鼠隨機(jī)分為模型組、前期干預(yù)組、后期短程干預(yù)組及后期長程干預(yù)組，每組14只，通過單次大劑量6MV-X線加速器胸部照射制成放射性肺損傷大鼠模型，分別不用及照射前2周內(nèi)、照射后1個月內(nèi)、照射后3個月內(nèi)用扶正活血中藥灌胃，于照射后3、6個月分別隨機(jī)處死各組大鼠7只，取大鼠肺組織進(jìn)行免疫組化檢測TGF-β1蛋白表達(dá)強(qiáng)度及觀察不同時相肺組織病理學(xué)特征。結(jié)果 各干預(yù)組大鼠肺組織TGF-β1蛋白表達(dá)強(qiáng)度明顯低于模型組，放射性肺損傷病理學(xué)改變明顯輕于模型組。結(jié)論 扶正活血中藥具有抑制TGF-β1分泌，有效阻止或延緩肺纖維化的形成，對放射性肺損傷的防治具有一定作用。

放射性肺損傷 扶正活血中藥 轉(zhuǎn)化生長因子β1

放射性肺損傷是腫瘤患者胸部放療后最常見的并發(fā)癥，輕者癥狀輕微，可自行消退，重者發(fā)生放射性肺炎及晚期肺纖維化，不僅影響療效，還影響患者的呼吸功能及生活質(zhì)量，甚至引起呼吸衰竭，危及生命。對于放射性肺損傷，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要采取激素類、抗氧化劑等治療，其不良反應(yīng)較多，且不宜大劑量和長期用藥。中醫(yī)藥具有毒副反應(yīng)少及價(jià)格低廉等優(yōu)勢，且能防治放射性肺損傷[1]。目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，多種細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)等生物活性分子在放射性肺炎、肺纖維化發(fā)生、發(fā)展中有重要作用，特別是轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）在放射性肺炎、肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[2]。肺纖維化過程涉及促纖維化細(xì)胞因子與抑纖維化細(xì)胞因子的相互作用，這兩類細(xì)胞因子表達(dá)失衡在很大程度上決定了早期肺損傷和后期肺纖維化發(fā)生的嚴(yán)重程度[3]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M臨床放射治療的過程，采用單次全胸照射大鼠造模，應(yīng)用扶正活血中藥進(jìn)行干預(yù)，觀察大鼠肺組織TGF-β1蛋白表達(dá)強(qiáng)度及肺組織病理學(xué)特征，探討扶正活血中藥對放射性肺損傷防治作用的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 健康成年清潔級SD雌性大鼠56只,體重（200±10）g，由溫州醫(yī)科大學(xué)動物房提供，實(shí)驗(yàn)前在清潔動物房常規(guī)飼養(yǎng)3d，觀察無異常者入組實(shí)驗(yàn)。多克隆兔抗體TGF-β1濃濃縮液購自博士德公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組 56只成年清潔級SD雌性大鼠隨機(jī)分為4組，每組14只：模型組（單純放射損傷）、前期干預(yù)組（照射前2周連續(xù)給藥）、后期短程干預(yù)組（前期不予中藥干預(yù)，照射后連續(xù)給藥1個月、后期長程干預(yù)組（前期不予中藥干預(yù)，照射后連續(xù)給藥3個月）。

1.2.2 模型制備 所有大鼠采用1%戊巴比妥鈉（0.3ml/ 100g）腹腔內(nèi)注射麻醉后，取仰臥位固定在自制的木架上，充分曝露胸部，用6MV-X線加速器，單次全胸照射25Gy，照射面積約3.5cm×4.0cm（上至兩腋窩，下至胸骨劍突，其余部分用10cm厚鉛磚屏蔽），照距為100.0cm，劑量率為320cGy/min。

1.2.3 中藥制備及給藥方式 扶正活血法基礎(chǔ)方由紅景天、生黃芪、黨參、白術(shù)、炙甘草、茯苓、丹參、川芎、當(dāng)歸、赤芍、丹皮、靈芝、生地黃、南沙參等常用中藥組成，所有藥物由我院中藥房提供并經(jīng)檢驗(yàn)合格，在制劑室水煎常溫低壓濃縮成3.14g/ml生藥濃度的藥液備用（每日劑量以成人按60kg體重與大鼠平均250g體重10倍系數(shù)換算），每只大鼠每日3ml灌胃1次。模型組：單純X線照射，前期及后期均不予中藥干預(yù)；前期干預(yù)組：X線照射前2周連續(xù)給予扶正活血湯中藥灌胃，照射后不作干預(yù)治療；后期短程干預(yù)組：前期不予中藥干預(yù)，照射后給予扶正活血湯連續(xù)灌胃1個月；后期長程干預(yù)組：前期不予中藥干預(yù)，照射后給予扶正活血湯連續(xù)灌胃3個月。

1.2.4 取材 每組大鼠分別在照射后3、6個月隨機(jī)抽取7只處死，迅速剖開胸腔，剪斷左右主支氣管，取大鼠右肺中葉，置于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)4μm石蠟切片，分別行常規(guī)HE染色（顯微鏡下觀察）及免疫組化檢測TGF-β1的表達(dá)水平。

1.2.5 免疫組化檢測 所有標(biāo)本均經(jīng)4%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，采用EnVision法，試劑以1∶100稀釋，具體操作步驟按說明書進(jìn)行，用高壓鍋高溫修復(fù)抗原，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固。以PBS代替一抗作為陰性對照。光鏡下觀察胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，顏色越深表達(dá)越強(qiáng)。

1.3 觀察指標(biāo) 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化及肺組織中TGF-β1蛋白表達(dá)強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 照射后3、6個月各組大鼠肺組織病理學(xué)變化 單純照射組：3個月時肺泡腔變小，肺間質(zhì)充血出血，肺泡間質(zhì)增厚，淋巴細(xì)胞浸潤及組織細(xì)胞反應(yīng)，可見增生活躍的纖維細(xì)胞（圖1）；6個月時肺組織正常結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間質(zhì)重度增厚，肺泡腔明顯萎陷乃至消失，纖維細(xì)胞明顯增多，發(fā)生纖維化，部分區(qū)域發(fā)生肺實(shí)變固縮，肺間質(zhì)可看到大量成熟粗大的膠原纖維，呈雜亂分布，尤其以支氣管周圍嚴(yán)重（圖2）。后期長程干預(yù)組：3個月時肺組織結(jié)構(gòu)正常，局灶間質(zhì)充血，少量淋巴細(xì)胞浸潤及組織細(xì)胞反應(yīng)，未見明確增生的纖維細(xì)胞（圖3）；6個月時肺組織結(jié)構(gòu)無明顯破壞，肺泡單位清晰，局灶間質(zhì)充血、出血、水腫，較多淋巴細(xì)胞浸潤、組織細(xì)胞反應(yīng)，局灶纖維組織增生，肺泡間隔增寬（圖4）。前期干預(yù)組與后期短程干預(yù)組：3個月時肺組織結(jié)構(gòu)無明顯破壞，局灶間質(zhì)充血、出血、水腫比后期長程干預(yù)組明顯，較多淋巴細(xì)胞浸潤、組織細(xì)胞反應(yīng)，但未見明確增生的纖維細(xì)胞（圖5、6）；6個月時肺正常結(jié)構(gòu)部分破壞，肺泡間隔增寬，較多淋巴細(xì)胞浸潤、組織細(xì)胞反應(yīng)，局灶纖維組織增生（圖7、8）。

2.2 照射后3個月各組大鼠肺組織TGF-β1蛋白表達(dá)情況 鏡下可見肺組織中TGF-β1蛋白陽性表達(dá)主要在肺泡上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、支氣管黏膜上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)中，多數(shù)細(xì)胞核呈藍(lán)色，部分細(xì)胞核呈棕黃色。前期干預(yù)組、后期短程干預(yù)組、后期長程干預(yù)組肺組織TGF-β1蛋白呈弱陽性表達(dá)，模型組TGF-β1蛋白表達(dá)強(qiáng)度明顯比上述3組強(qiáng)（圖9～12）。

3 討論

目前認(rèn)為，放射性肺損傷的發(fā)生和發(fā)展是多細(xì)胞因子相互影響和綜合作用的結(jié)果[4]。放射性肺損傷發(fā)生過程中，肺泡上皮細(xì)胞、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞為主要的效應(yīng)細(xì)胞，其產(chǎn)生的細(xì)胞因子誘導(dǎo)早期的炎癥反應(yīng)和后期的纖維化形成是損傷發(fā)生的主要病理機(jī)制。而TGF-β1是血漿中主要的細(xì)胞因子形式，其功能有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，抑制肺泡上皮細(xì)胞增殖，免疫抑制，控制細(xì)胞外基質(zhì)的自身穩(wěn)定，促纖維化作用[5]。本實(shí)驗(yàn)采用雙肺單次X線照射造模，引起實(shí)驗(yàn)性大鼠的肺放射性損傷，并用扶正活血中藥進(jìn)行干預(yù)治療，從組織病理學(xué)上觀察發(fā)現(xiàn)各干預(yù)組肺的炎癥反應(yīng)及肺的纖維化明顯減輕，并且以后期長程干預(yù)組最為明顯。同時，我們還發(fā)現(xiàn)扶正活血中藥可延緩肺部炎癥及纖維化的發(fā)展，以后期長程干預(yù)最為顯著。通過免疫組化法檢測3個月各組肺組織TGF-β1蛋白的表達(dá)強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)各干預(yù)組TGF-β1蛋白呈弱陽性表達(dá)，而模型組TGF-β1蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)，提示扶正活血中藥具有下調(diào)TGF-β1水平，進(jìn)而抑制肺成纖維細(xì)胞的增殖活力及肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞纖維連接蛋白的合成，進(jìn)一步抑制細(xì)胞外基質(zhì)改建而達(dá)到阻止或延緩肺纖維化的形成[6]。

圖1 單純照射3個月——肺泡腔變小，肺泡間質(zhì)增厚，淋巴細(xì)胞浸潤及組織細(xì)胞反應(yīng)，可見增生活躍的纖維細(xì)胞

圖2 單純照射組6個月——肺組織正常結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間質(zhì)重度增厚，肺泡腔明顯萎陷乃至消失，纖維細(xì)胞明顯增多，發(fā)生纖維化

圖3 后期長程干預(yù)組3個月組——肺組織結(jié)構(gòu)正常，未見明確增生的纖維細(xì)胞

圖4 后期長程干預(yù)組6個月——肺組織結(jié)構(gòu)無明顯破壞，局灶間質(zhì)充血、出血、水腫，較多淋巴細(xì)胞浸潤、組織細(xì)胞反應(yīng)

圖5 前期干預(yù)組3個月——肺組織結(jié)構(gòu)無明顯破壞，局灶間質(zhì)充血，淋巴細(xì)胞浸潤，未見明確增生的纖維細(xì)胞

圖6 后期短程干預(yù)組3個月——肺組織結(jié)構(gòu)無明顯破壞，局灶間質(zhì)充血，淋巴細(xì)胞浸潤，未見明確增生的纖維細(xì)胞

圖7 前期干預(yù)組6個月——肺正常結(jié)構(gòu)部分破壞，肺泡間隔增寬，較多淋巴細(xì)胞浸潤、組織細(xì)胞反應(yīng)，局灶纖維組織增生

圖8 后期短程干預(yù)組6個月——肺正常結(jié)構(gòu)部分破壞，肺泡間隔增寬，較多淋巴細(xì)胞浸潤、組織細(xì)胞反應(yīng)，局灶纖維組織增生

圖9 單純照射3個月——肺泡上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、支氣管黏膜上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞TGF-β1呈強(qiáng)陽性

圖10 后期長程干預(yù)組3個月組——肺泡上皮及間質(zhì)細(xì)胞TGF-β1呈弱陽性

圖11 前期干預(yù)組3個月——肺泡上皮及間質(zhì)細(xì)胞TGF-β1呈弱陽性

圖12 后期短程干預(yù)組3個月——肺泡上皮及間質(zhì)細(xì)胞TGF-β1呈弱陽性

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，放射線是熱毒之邪，并具有穿透性。肺組織受到放射輻照后，不僅直接損傷肺臟血絡(luò)，耗氣灼血，而且熱毒襲肺，肺熱內(nèi)壅，脈絡(luò)瘀阻[7]。因此，正氣不足、瘀血阻滯為主要病機(jī)，肺、脾、腎三臟氣陰受損是其發(fā)病的根本，而瘀血、阻滯是貫穿于病變始終的重要病理環(huán)節(jié)?；钛龇▽M織纖維化病變具有一定的阻斷與治療作用，治療以扶正活血為主。本研究由紅景天、生黃芪、黨參、白術(shù)、炙甘草、茯苓、丹參、川芎、當(dāng)歸、赤芍、丹皮、靈芝、生地黃、南沙參14味常用中藥組成扶正活血法基礎(chǔ)方，給大鼠灌胃，以扶正療法為主，大補(bǔ)元?dú)?，使機(jī)體的正氣增強(qiáng)，抗放射性損傷的能力增強(qiáng)，從而減輕放射性損傷的程度，減少放射性損傷的發(fā)生率。結(jié)果顯示扶正活血中藥可減輕肺損傷的程度，有效阻止或延緩肺纖維化的形成。

綜上所述,我們認(rèn)為放射性肺炎貴在早期預(yù)防，且治療越早效果越好。扶正活血中藥能降低放射性肺損傷大鼠TGF-β1蛋白的表達(dá)強(qiáng)度，有較好的防治放射性肺損傷作用，但扶正活血中藥防治放射性肺損傷的確切作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Protective effects of Chinese medicine of Fuzheng Huoxue on radiation-induced lung injury in rats

ZHENG Haihong,GAN Meifu, WENG Shouxiang,et al.
Department of Pathology,Taizhou Enze Medical Center,Taizhou Hospital of Zhejiang Province,Linhai 317000,China

Objective To investigate the effect of Chinese med icine of Fuzheng Huoxue on radiation-induced lung injury in rats.Methods Fifty six S-D rats were random ly allocated into irradiation g roup(n=14),early intervention g roup(n=14), short-term intervention group(n=14),long-term intervention g roup(n=14).The rad iation lung injury was induced by irrad iation on chestof rats w ith a sing le large dose using 6-MV linear accelerator.Chinese medicine of Fuzheng Huoxue was adm inistrated by gavage at 2 weeks before irradiation(early intervention group),w ithin 1 month or 3 months after irrad iation(short-term or long-term intervention groups),respectively.The animals were sacrificed at the end of the 3 and 6 months after irrad iation(7 in each batch).The histopathological changes of lungs was observed and the exp ression of TGF-β1in lung tissue was detected w ith immunohistochem istry.Results The exp ression of TGF-β1in intervention groups was significantly lower than that in modelg roup.Compared tomodelg roup the histopathological changes of rad iation-induced lung injury were significantly ameliorated in intervention groups.Conclusion Chinese medicine of Fuzheng Huoxue can alleviate or delay the rad iation-induced lung injury in rats,whichmay be associated with the down-regulation of TGF-β1exp ression in lung tissue.

Radiation-induced lung injury Fuzheng huoxue Recipe TGF-β1

2013-12-18）

（本文編輯：沈叔洪）

浙江省中醫(yī)藥攀登工程建設(shè)資助項(xiàng)目（2010ZA117）

317000臨海，臺州恩澤醫(yī)療中心（集團(tuán)）浙江省臺州醫(yī)院病理科（鄭海紅、甘梅富、翁壽向、徐鋮），中醫(yī)科（葛震）

甘梅富，E-mail：gmeifu@sohu.com