瞿海江 張筱華 黃關(guān)立 胡哲 魏志平

miR-212在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達及效應分析

瞿海江 張筱華 黃關(guān)立 胡哲 魏志平

目的 分析miR-212在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達及與乳腺癌臨床病理特征之間的相關(guān)性，并分析其效應。方法 采用莖環(huán)RT-qPCR方法檢測38例乳腺癌及癌旁正常乳腺組織標本中miR-212的表達，統(tǒng)計分析其表達水平與乳腺癌常用臨床病理指標間的關(guān)系。不同濃度miR-212 inhibitor轉(zhuǎn)染MCF7乳腺癌細胞，通過MTT法分析細胞活性，通過Tran-swell實驗檢測細胞的侵襲能力。 結(jié)果 與癌旁正常乳腺組織比較，乳腺癌組織中miR-212的表達明顯升高（P＜0.05）；分析miR-212表達水平與乳腺癌常用臨床病理指標間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，miR-212表達水平與乳腺癌細胞與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)及增殖指數(shù)（ki67）相關(guān)（P＜0.05），與月經(jīng)狀況、腫塊大小、雌激素和孕激素受體狀態(tài)、Her-2表達未見顯著相關(guān)性（P＞0.05）。細胞干預實驗顯示，與空白對照組、陰性對照組比較，miR-212 inhibitor可明顯抑制MCF7細胞增殖活性（P＜0.05）和細胞遷移（P＜0.01）。 結(jié)論 乳腺癌組織高表達的miR-212在乳腺癌發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，有望成為乳腺癌防治的一個新靶點。

微小RNA miR-212 乳腺癌

長度約22nt的內(nèi)源性小RNA，即micro RNA（miRNA），通過調(diào)控癌基因或抑癌基因的表達，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要的調(diào)控作用，是目前腫瘤研究領域的熱點[1-2]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-212（miR-212）的表達與肺癌[3]、胰腺癌[4]、胃癌[5]等多種腫瘤相關(guān)，但其表達與乳腺癌的相關(guān)性少有研究。為此，本研究采用莖環(huán)RT-qPCR方法檢測了38例乳腺浸潤性導管癌中mir-212的相對表達，分析其與臨床病理特征的關(guān)系，并通過化學合成的miR-212 inhibitor轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞，下調(diào)其表達，分析其對細胞增殖、侵襲和遷移的影響。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

1.1.1 標本來源及保存 2012年11月至 2013年12月溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科及臺州市腫瘤醫(yī)院腫瘤外科收治的乳腺浸潤性導管癌患者37例，年齡32～67歲，中位年齡49歲；術(shù)前未行放、化療。每例標本留取腫瘤組織及對應的距腫瘤5cm以上的癌旁正常乳腺組織，標本離體后10min內(nèi)置于液氮保存。

1.1.2 主要試劑 mirVanaTMmiRNA分離試劑盒、Lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Life Technologies公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、SYBR Mastermix購自日本東洋紡（上海）生物科技有限公司；細胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）購自日本同仁化學所；Matrigel購自美國BD Bioscience公司；Tran-swell小室購自美國Costar公司；DMEM為美國Gibico公司產(chǎn)品，胎牛血清（FBS）為美國Gibico公司產(chǎn)品。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；miR-212 inhibitor由上海吉瑪生物公司合成。MCF7乳腺癌細胞購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。

1.2 方法

1.2.1 小RNA的提取 取液氮保存的乳腺腫瘤及正常乳腺組織標本，在液氮中碾碎至粉狀，按mirVanaTMmiRNA分離試劑盒說明書提取miRNA，DEPC處理水溶解。采用德國EPPENDORF公司分光光度儀（Biophotometer）檢測RNA溶液OD260/OD280吸光值，計算RNA濃度和純度。

1.2.2 miR-212表達檢測 采用莖環(huán)RT-qPCR方法，以U6作為內(nèi)參，分析miR-212表達。相關(guān)分析的引物序列見表1。0.1μg小RNA以U6和miR-212莖環(huán)RT引物分別進行逆轉(zhuǎn)錄，反應條件為：16℃30min，42℃30min，75℃15min,反應結(jié)束后-20℃保存。以15μl反應體系進行Real-time定量PCR。miRNA檢測反應體系包括：1μl RT產(chǎn)物，1×SYBR Green I Mastermix，0.5μM特異前向引物、0.5μM特異反向引物。Real-time定量PCR條件為：95°C 10min后,95°C 15s，60°C 1min，40循環(huán)。Real-time定量 PCR使用 Applied Biosystems 7500儀器進行。所有樣品做3復孔。采用定量PCR中的相對定量法，以N=2-ΔΔCt表示腫瘤組織miRNA表達相對于配對的正常組織的變化倍數(shù)，其中ΔΔCt=（CtmiR-212-CtU6）腫瘤-（CtmiR-212-CtU6）正常。

表1 引物序列

1.2.3 CCK-8檢測MCF7細胞miR-212 inhibitor轉(zhuǎn)染增殖能力 MCF7乳腺癌細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期的細胞，胰酶消化細胞并計數(shù)，以2×105/孔接種于96孔培養(yǎng)板，按照Lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。實驗分3組：（1）空白對照組，僅加入脂質(zhì)體；（2）無關(guān)序列組，加入無關(guān)序列和脂質(zhì)體；（3）miR-212干預組,加入20、40、80nM miR-212 inhibitor和相應劑量的脂質(zhì)體。每組設3個復孔。分別在轉(zhuǎn)染24h、48h后，按CCK-8試劑盒說明書檢測腫瘤細胞的活性。所有實驗重復3次。

1.2.4 Transwell侵襲實驗檢測腫瘤細胞的侵襲能力 按TranswellTM說明書，將Matrigel預冷成液態(tài)，用無血清培養(yǎng)液1∶1稀釋，加入Transwell小室，每孔15μl，37℃包被1 h，以無血清培養(yǎng)液洗3次后備用。按照 Lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染的MCF7細胞去培養(yǎng)基，PBS液洗3次。在Transwell小室上部培養(yǎng)嵌室（insert）內(nèi)加入1×104/孔細胞懸液，每組設3個復孔。向底部培養(yǎng)室加入600μl含15%FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)液。37℃、5%CO2培養(yǎng)24h。吸去嵌室內(nèi)的液體,用棉棒擦去嵌室底部內(nèi)表面上的細胞，將嵌室浸入固定液（50%甲醇）固定15min，PBS洗3遍。結(jié)晶紫染色30min。風干后，熒光顯微鏡下每個培養(yǎng)孔隨機選擇10個視野拍照計數(shù)，并計算每個視野的平均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學處理 miRNA-212表達數(shù)據(jù)以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示。采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件的非參數(shù)Wilcoxon符號秩檢驗（配對的正常和腫瘤組），Mann-Whitney U檢驗和Kruskal-Wallis H檢驗進行統(tǒng)計處理。

2 結(jié)果

2.1 miR-212在乳腺癌及對應正常乳腺組織中的表達 如圖1所示，miR-212及U6的RT-PCR產(chǎn)物的溶解曲線為單峰，說明莖環(huán)RT-qPCR可以特異檢測miR-212及U6。以U6為內(nèi)參，檢測乳腺癌及對應正常乳腺組織miR-212的表達。結(jié)果顯示（圖2）與對應正常乳腺組織比較，miR-212在37例乳腺癌組織中表達明顯升高，其相對表達量為2.704（1.354，3.745）。采用配對樣本的Wilcoxon符號秩檢驗其差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.0001）。

2.2 miR-212表達與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 見表2。

由表2可見，miR-212在乳腺癌組織中的表達與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及增殖指數(shù)（ki67）相關(guān)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組miR-212的表達顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P=0.003）；mir-212表達水平在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期TNM分期的乳腺癌組織中位表達值分別為I期1.452、2.633、4.422，3個時期表達水平差異有統(tǒng)計學意義（P=0.015）；此外mir-212的表達還和ki67有關(guān)，在高ki67組（ki67＞10%）乳腺癌組織miR-212的表達顯著高于低ki67組（ki67≤10%，P=0.013）。mir-212的表達和月經(jīng)狀況、腫塊大小、雌激素和孕激素受體狀態(tài)及Her-2表達未見顯著相關(guān)性。

2.3 miR-212干預對MCF7乳腺癌細胞增殖的影響 為分析miR-212在乳腺癌中的作用，不同濃度miR-212inhibitor轉(zhuǎn)染MCF7乳腺癌細胞，下調(diào)細胞內(nèi)miR-212的表達，通過MTT法分析細胞活性的影響。圖3結(jié)果顯示，與空白對照組、陰性對照組比較，20、40、80nM的miR-212 inhibitor轉(zhuǎn)染均可顯著抑制MCF7細胞增殖（P＜0.05），不同濃度間差異無統(tǒng)計學意義。

圖1 m i R-212及U6莖環(huán)RT-real t i m ePCR熔解曲線

圖2 m i R-212在乳腺癌組織及其配對癌旁正常組織中的相對表達水平（*P＜0.01）

不同濃度miR-212 inhibitor轉(zhuǎn)染MCF7細胞48h后,采用Tran-swell侵襲實驗檢測各組細胞的侵襲能力。圖4結(jié)果顯示，與空白對照組、陰性對照組比較，20、 40、80nm的miR-212 inhibitor轉(zhuǎn)染組明顯抑制細胞遷移（P＜0.01）。

表2 乳腺浸潤性導管癌中m i r-212表達和臨床病理因素的相關(guān)性

3 討論

miRNA是在真核生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性非編碼微小RNA，廣泛存在于動植物中，在進化上具有保守性及時間和空間特異性[6]。目前人類已發(fā)現(xiàn)超過2 588種成熟的miRNA（http://www.mirbase.org），它們通過改變互補序列的miRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率調(diào)控人類約1/3的編碼基因[6-7]，廣泛參與到細胞分化、增殖、衰老、凋亡、遷移和侵襲等過程中[8-9]。自2002年Galin等[10]首次報道m(xù)iRNA水平的異常表達可能與腫瘤相關(guān)，miRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用越來越受到重視。

圖3 m i R-212 i nhi bi t or干預對M CF7乳腺癌細胞增殖的影響 [與空白（Bl ank）組及對照（NC）組比較，*P＜0.05]

miR-212是一種廣泛調(diào)節(jié)效應的miRNA，其基因定位于17p13.3區(qū)域。除外參與小鼠乳腺發(fā)育[11-12]、神經(jīng)元[13-14]、免疫細胞[15-16]功能的調(diào)節(jié)，miR-212還參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。但miR-212在不同的腫瘤組織存在不同的表達的模式。在非小細胞肺癌[17]、口腔癌[18]、胰腺癌[19]等腫瘤上調(diào)表達，而在肝細胞肝癌[20]、胃癌[21]、結(jié)腸癌[22]、前列腺癌[23]等卻是下調(diào)表達。然而，乳腺癌組織miR-212表達及效應迄今尚未見報道。為分析miR-212與乳腺癌的關(guān)系，本研究以U6為內(nèi)參，應用莖環(huán)RT-PCR檢測了32例乳腺癌組織miR-212的表達，結(jié)果顯示，miR-212在乳腺癌組織的表達高于對應的正常組織。進一步分析miR-212表達水平與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，mir-212表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及ki67相關(guān)。進一步通過瞬時轉(zhuǎn)染miR-212 inhibitor干預實驗發(fā)現(xiàn)，miR-212下調(diào)表達后明顯抑制MCF7乳腺癌細胞的增殖及侵襲。這些結(jié)果提示，miR-212在乳腺癌中可作為促癌基因參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程。

已鑒定的miR-212靶基因包括：Patched-1（TCH1）[17]、乙酰膽堿酯酶、CYP2E1[24]、Bcl-6[15]、錳超氧化物歧化酶（MnSOD）[22]、IRAK4[16]、PTEN、FOXO3a、p300[14]等。不同類型的腫瘤其調(diào)控的靶基因也不盡相同。Ma C等報道m(xù)iR-212過表達通過對PTCH1的調(diào)控，促進胰腺癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[17]。Lu等[25]報道，miR-212通過對乙酰膽堿酯酶的調(diào)節(jié)是其非小細胞肺癌重要機制。此外，miR-212通過調(diào)控視網(wǎng)膜細胞瘤結(jié)合蛋白2（RBP2）表達參與了肝癌[20]和胃癌[21]的發(fā)病過程。迄今miR-212參與乳腺癌的調(diào)控靶點尚未明確，miR-212參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展機制過程的調(diào)控機制需進一步研究。

圖4 m i R-212干預對M CF7乳腺癌細胞侵襲能力的影響[與空白（Bl ank）組及對照（NC）組比較，*P＜0.01]

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Analysis of the expression and effectin invasive ductal carcinoma of the breastmiR-212

QU Haijiang, ZHANG Xiaohua, HUANG Guanli, etal.
Departmentof Tumor Surgery, theFirstAffiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,China

Objective To investigate the expression of miR-212 in breast invasive ductal carcinoma and its correlation with clinicopathological characteristics of the cancer. Methods The expression of miR-212 was detected by loop RT-qPCR in cancer and pericancerous tissue specimens of 38 breast cancer patients.The relationship between miR-212 expression l and clinicopathological characteristics was analyzed.MiR-212 inhibitor was transfected into human breast cancer MCF7 cells,then cell proliferation was determined by MTT method and cell invasive ability was measured by Tran-swell assay. Results Compared pericancerous breast tissues,the expression of miR-212 in cancer tissues was significantly higher(P＜0.05);the expression level of miR-212 was correlated with lymph node metastasis,TNM staging and proliferation index(Ki67)(P＜0.05),not correlated with menopausal status,tumor size,estrogen and progesterone receptor status,and Her-2 status(P＞0.05).Compared with the blank control group and negative control group,miR-212 inhibitor significantly inhibited cell proliferation(P＜0.05)and migration (P＜0.01)in MCF7 cells. Conclusion MiR-212 is high expressed in breast cancer,which may be involved in the development of breast carcinoma,indicating miR-212 might be a new target in breast cancer therapy.

microRNA miR-212 Breast cancer

2014-09-15）

（本文編輯：田云鵬）

325000 溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤外科（瞿海江、張筱華、黃關(guān)立，瞿海江系在職研究生，現(xiàn)在臺州市腫瘤醫(yī)院腫瘤外科工作）；臺州市腫瘤醫(yī)院腫瘤外科（胡哲、魏志平）