鄭超波 劉建榮

●基礎(chǔ)研究

通心絡(luò)對腦缺血再灌注損傷的保護作用研究

鄭超波 劉建榮

目的 研究通心絡(luò)對腦缺血再灌注損傷小鼠腦組織神經(jīng)保護作用的機制。方法 將126只成年雄性小鼠按隨機數(shù)字表法分為全程給藥組、預(yù)處理組及對照組，每組各42只，均建立腦缺血再灌注損傷模型。全程給藥組于造模前7d每天連續(xù)給予12.5ml/kg劑量的通心絡(luò)溶液（0.08g/ml），造模后繼續(xù)給予相同劑量的通心絡(luò)至各處死時間點或?qū)嶒灲K點；預(yù)處理組造模前給藥同全程給藥組。對照組于造模前7d連續(xù)給予等體積的0.9%氯化鈉溶液。對造模后1、3、7和14d小鼠腦缺血損傷后神經(jīng)行為學(xué)改變進行改良神經(jīng)功能評分，并測定造模后1d和3d腦梗死體積、腦組織含水量及細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-αmRNA水平。結(jié)果 全程給藥組、預(yù)處理組造模后1、3、7、14d的神經(jīng)功能評分均較對照組低，但僅全程給藥組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；全程給藥組、預(yù)處理組造模后1、3d的腦梗死體積及腦組織含水量均較對照組小，但僅全程給藥組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；全程給藥組造模后1、3d腦組織中IL-6和IL-1βmRNA水平較對照組低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）,TNF-α mRNA水平雖較對照組低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），預(yù)處理組中各時點IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA水平均較對照組高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。結(jié)論 通心絡(luò)對腦缺血再灌注損傷有神經(jīng)保護作用，其作用機制可能是減輕了腦組織中的炎癥反應(yīng)。

通心絡(luò) 腦缺血 炎癥因子 IL-6 IL-1β TNF-α

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of Chinese medicine Tongxinluo on cerebral ischemia reperfusion injury in mice.Methods Adult male mice(n=126)were randomly divided into 3 groups:treatment group,pretreatment group and control group(n=42 in each group).Cerebral ischemia reperfusion was induced by suture method.Tongxinluo,made into revolution of 0.08g/ml,12.5ml/kg was administered by gavage daily for 7days before surgery in treatment and pretreatment groups,same volume of normal saline was given into mice in control group.Tongxinluo 12.5ml/kg was aslo adminstered to mice in treatment group after surgery until the animals were sacrificed.The neurological function scores were evaluated at d1,d3,d7,d14 after surgery;the brain infarct volume,brain water content and the expression of IL-6, IL-1β,TNF-αmRNA in brain tissue were determined at d 1 and d3 after surgery. Results Compared with the control group,the nerve function scores at d1,d3,d7,d14 after surgery in treatment group were significant lower(P＜0.05).Compared with control group,the volume of cerebral infarction and the water content of brain tissue at d1,d3 after surgery in treatment group were significantly reduced(P＜0.05).Compared with the control group,the expression of IL-6 and IL-1βmRNA in brain tissue of treatment group was significantly lower(P＜0.05). Conclusion Chinese medicine Tongxinluo can protect brain tissue from ischemia reperfusion injury and reduce brain inflammation in mice.

通心絡(luò)膠囊由12種傳統(tǒng)中藥成分按照一定比例混合而成，已被中國食品藥品監(jiān)督管理局批準用于治療糖尿病、冠心病等多種疾?。谎芯孔C實通心絡(luò)膠囊有抗血小板以及保護血管作用[1-2]。臨床研究還發(fā)現(xiàn)，通心絡(luò)膠囊對缺血性腦卒中有一定治療作用，但是其神經(jīng)保護作用的機制尚未明確。本研究采用小鼠腦組織缺血再灌注模型，觀察通心絡(luò)粉劑減少缺血再灌注后的腦梗死體積、減輕腦水腫及改善神經(jīng)功能評分的效果，進一步探索通心絡(luò)粉神經(jīng)保護作用的機制。

1 材料和方法

1.1 藥物準備 將通心絡(luò)膠囊（石家莊以嶺制藥有限公司，國藥準字Z20060322）粉劑（直徑≤10μm）溶解于0.9%氯化鈉溶液中，配置成濃度為0.08g/ml的溶液儲存于4°C冰箱中。每次給藥時提前30min取出，待復(fù)溫至室溫時按照實驗設(shè)計中的分組和劑量進行灌胃給藥。

1.2 實驗動物和分組 成年雄性小鼠126只（由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，合格證號 SCXK（滬）2013-0016，2級，體質(zhì)量25～30g），按隨機數(shù)字表法分為3組，每組42只。（1）預(yù)處理組：于造模前7d連續(xù)給予12.5ml/kg劑量的通心絡(luò)溶液（0.08g/ml）直至手術(shù)前1d。（2）全程給藥組：于造模前7d連續(xù)給予12.5ml/kg劑量的通心絡(luò)，造模后繼續(xù)給予相同劑量的通心絡(luò)至各處死時間點或?qū)嶒灲K點。（3）對照組：于造模前7d連續(xù)給予等體積的0.9%氯化鈉溶液。每組小鼠分別在造模后1、3d時各處死18只，用于腦梗死體積、腦組織含水量及炎癥因子（IL-6、IL-1β和TNF-α）mRNA表達水平的測定（每項測定每組各6只）；每組剩余的6只小鼠于造模后1、3、7、14d觀察神經(jīng)功能評分。

1.3 腦缺血再灌注模型建立 將6-0栓線的尖頭靠近高溫燒灼器燒成圓頭，切割1.5cm，然后將栓線伸入含有硅橡膠的PE-10管中，包裹長度約2.0mm，沾有硅橡膠的線拴直徑約為0.25mm，自然晾干。手術(shù)參考既往文獻介紹的方法，將線栓從左側(cè)頸外動脈處逆行插向頸總動脈的分叉處，再將線栓轉(zhuǎn)至頸內(nèi)動脈腔，動作輕緩小心地經(jīng)顱內(nèi)段頸內(nèi)動脈插入至感到輕微阻力，進線深度為（0.90±0.05）cm，用套線將線栓固定在頸外動脈殘端，90min后拔出線栓。在手術(shù)過程中，利用熱毯將小鼠的體溫保持在37℃左右[3]。造模成功的標準為：線栓阻塞大腦中動脈（小鼠前囟旁開2mm）血流量后下降至阻塞前的20%以下，拔出后恢復(fù)至原來的80%以上；動物蘇醒后表現(xiàn)為下列體征之一：站立和爬行時出現(xiàn)右側(cè)傾倒和右側(cè)劃圈，左側(cè)的眼裂減?。℉orner征），提尾時出現(xiàn)右側(cè)前肢的內(nèi)收及屈曲。

1.4 小鼠神經(jīng)功能評分 對造模后1、3、7和14d小鼠腦缺血損傷后神經(jīng)行為學(xué)改變進行改良神經(jīng)功能評分（根據(jù)小鼠的運動、感覺、平衡及反射綜合評分[4]），包括提尾（0～3分）、爬行（0～3分）、平衡木實驗（0～6分）以及反射缺失（0～2分），總分0～14分，分數(shù)越高損傷程度越重。

1.5 腦梗死體積測定 采用焦油紫染色法，將取出的小鼠腦組織保存在-40°C的異戊烷中，用冷凍切片機切取20μm的腦組織冠狀切片。將切片浸入含有0.05%焦油紫的染色缸中染色，采用Image J軟件測定腦片中相應(yīng)面積，并按已有計算公式獲得整個腦組織的梗死體積[5]。

1.6 腦組織含水量測定 小鼠在造模后1d和3d用過量10%水合氯醛深度腹腔麻醉，取出腦組織，分析天平上秤量其濕重，在100°C真空干燥箱中脫水24h，并再次稱取干重。腦組織含水量（%）=[（濕重-干重）/濕重]×100%。

1.7 腦組織中炎癥因子mRNA表達水平測定 使用TRIzol試劑盒（美國Invitrogen公司）提取腦組織中的總RNA，并根據(jù)試劑盒要求溶于40μl去除RNA酶的離子水中。微量分光光度儀（美國Thermo公司，NanoDrop1000型號）檢測總RNA純度及濃度。擴增過程使用快速RT-PCR系統(tǒng)（美國ABI公司，7900HT型）和SYBR Premix Ex Tag試劑盒（中國寶生物公司）。總共3個過程，分別為一個循環(huán)的預(yù)變性：95°C 30s，40個循環(huán)的變性：95°C 5s，退火、延伸：60°C 30s。以管家基因GAPDH為內(nèi)參，校正每個樣品的Ct值，以2-ΔΔCt值的均數(shù)作統(tǒng)計圖，2-ΔΔCt值的均數(shù)代表IL-6、IL-1β及TNF-α mRNA炎癥因子的標準化數(shù)目。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠神經(jīng)功能評分及梗死體積的比較 見表1、2。

表1 3組小鼠神經(jīng)功能評分比較

表2 3組小鼠腦梗死體積比較（mm3）

由表1可見，全程給藥組、預(yù)處理組造模后1、3、7、14d的神經(jīng)功能評分均較對照組低，但僅全程給藥組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而預(yù)處理組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

由表2可見，全程給藥組、預(yù)處理組造模后1、3d的梗死體積均較對照組小，但僅全程給藥組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而預(yù)處理組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 3組小鼠梗死側(cè)腦組織含水量的比較 見表3。

由表3可見，全程給藥組、預(yù)處理組造模后1、3d梗死側(cè)皮層與基底核的含水量均較對照組少，但僅全程組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而預(yù)處理組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 3組小鼠梗死側(cè)腦組織含水量的比較（%）

2.3 3組小鼠腦組織中炎癥因子mRNA表達水平比較 見表4。

表4 3組小鼠腦組織中炎癥因子mRNA表達水平的比較

由表4可見，全程給藥組造模后1、3d腦組織中IL-6和IL-1βmRNA表達水平較對照組低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），TNF-α mRNA表達水平雖較對照組低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。預(yù)處理組中各時點IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表達水平均較對照組高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

3 討論

缺血性腦損傷的炎癥反應(yīng)是由多種細胞因子介導(dǎo)的一種級聯(lián)反應(yīng)過程，炎癥反應(yīng)是造成腦缺血再灌注損傷的主要原因。局部炎癥因子的表達上調(diào)構(gòu)成了缺血損傷向炎癥性損傷轉(zhuǎn)變的基礎(chǔ)，隨后白細胞向缺血區(qū)的聚集和浸潤導(dǎo)致了繼發(fā)性神經(jīng)元損傷和梗死面積的擴大。

IL-1在機體感染、損傷、炎癥及免疫反應(yīng)等過程中起關(guān)鍵作用，存在形式有IL-1α和IL-1β，其中IL-1β是一種多效性的細胞因子，是腦I/R中觸發(fā)炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)之一，主要由血管內(nèi)皮細胞、膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元等活化表達[6]。生理條件下，腦內(nèi)IL-1β水平很低，腦缺血后IL-1β表達上調(diào)，可刺激細胞黏附分子的產(chǎn)生，引起中性粒細胞聚集，誘導(dǎo)多種細胞因子的表達[7]。研究證實，而IL-1受體拮抗劑能減小腦梗死灶體積，減輕血腦屏障損害，抑制小膠質(zhì)細胞活化及中性粒細胞浸潤，對腦缺血有神經(jīng)保護作用[8]。

TNF-α是缺血再灌注損傷中起重要作用的炎性細胞因子，人體內(nèi)正常水平的TNF-α可介導(dǎo)抗腫瘤及調(diào)節(jié)機體的免疫功能，在機體對疾病的防御及損傷修復(fù)等過程中起著重要作用，但是TNF-α產(chǎn)生過多反而會加重腦細胞損害，通過介導(dǎo)炎性反應(yīng)，直接的細胞毒性反應(yīng)及促凝等作用參與缺血性腦損害的發(fā)生、發(fā)展，可能會增加局部梗死灶的敏感性和危險性。腦缺血后，腦組織中增高的TNF-α可直接破壞血腦屏障，使其通透性增加，引起腦細胞特別是星形膠質(zhì)細胞的腫脹和變性，繼而釋放花生四烯酸代謝產(chǎn)物、氧自由基、脂質(zhì)過氧物等各種神經(jīng)毒性因子，并進一步加重細胞毒性水腫[9]。

研究證實IL-6對急性腦缺血后腦損傷的作用包括：（1）誘導(dǎo)缺血區(qū)B細胞、T細胞分化，增強免疫應(yīng)答。（2）抑制TNF-α分泌，促進星形細胞有絲分裂，協(xié)同神經(jīng)生長因子保護膽堿能神經(jīng)元及兒茶酚胺能神經(jīng)元，并促進其生長，都提示IL-6對腦缺血后有神經(jīng)保護作用[10]。雖然也有研究發(fā)現(xiàn)缺血后外周血中IL-6升高的水平與腦梗死范圍及神經(jīng)功能損傷程度呈正相關(guān)[11]，但是目前多數(shù)觀點認為IL-6對于腦缺血有神經(jīng)保護作用。

雖然目前大量的研究都證實通心絡(luò)對腦缺血有神經(jīng)保護作用，但是其有關(guān)機制目前知之甚少。本次研究中我們發(fā)現(xiàn)通心絡(luò)能減小腦缺血再灌注后梗死體積，減輕梗死側(cè)水腫程度，并且改善缺血后神經(jīng)功能缺損程度；并且通過后面的研究發(fā)現(xiàn)通心絡(luò)全程給藥組減少腦缺血后炎癥因子IL-1β的表達，提示減少缺血后炎癥反應(yīng)是通心絡(luò)的神經(jīng)保護作用機制；但是同時發(fā)現(xiàn)，兩種不同給藥方式對具有神經(jīng)保護作用的炎癥因子IL-6的不同影響以及預(yù)先給予通心絡(luò)增加缺血后炎癥因子IL-1β的表達，提示通心絡(luò)對缺血后神經(jīng)保護作用還可能有其他機制的參與，如對氧化應(yīng)激、氧自由基及神經(jīng)凋亡等方面；預(yù)先服用通心絡(luò)可以促進IL-6的表達，提示通心絡(luò)也可能應(yīng)用于腦缺血的二級預(yù)防中。通過本次研究為通心絡(luò)在治療腦梗死臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)，通心絡(luò)對腦缺血后的神經(jīng)凋亡、氧化應(yīng)激等方面的研究及影響炎癥因子機制的研究尚還需進一步的研究。

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（本文編輯：楊麗）

《浙江醫(yī)學(xué)》“病例討論”欄目征稿

根據(jù)廣大讀者的建議，本刊自2010年第7期起開辟“病例討論”欄目，論文結(jié)構(gòu)分為“病例摘要”和“討論”兩部分，以期通過對疑難、復(fù)雜或罕見病例的介紹和討論，交流臨床工作經(jīng)驗，幫助廣大臨床醫(yī)師掌握科學(xué)的臨床思維方式，提高各?？坪投鄬W(xué)科的綜合分析判斷能力，進而提高醫(yī)療水平。現(xiàn)特向廣大臨床醫(yī)師征集相關(guān)病例，具體要求如下。

1病例選擇 （1）疑難病例，特別是涉及多學(xué)科、多領(lǐng)域的疑難病例；（2）診斷明確，但病情危重和（或）治療棘手的病例；（3）臨床較罕見的病例。以上病例均需最終獲得明確診斷或成功治療，且臨床資料齊全，并能提供實驗室、影像學(xué)和（或）病理確診依據(jù)。

2寫作格式和要求（1）病歷摘要：分段敘述患者的簡要病史（包括主訴、現(xiàn)病史、既往史等）、入院后體檢情況、輔助檢查結(jié)果、入院后治療方案及病情變化等內(nèi)容；（2）討論：分段記錄各級或各科或各院醫(yī)師對該病例的特點、診斷、鑒別診斷、進一步輔助檢查和治療方案等方面的分析，若為罕見病，則需介紹目前國內(nèi)外關(guān)于該病診治方面的最新進展；（3）列出相關(guān)的國內(nèi)外主要參考文獻；（4）全文字數(shù)在3 000字左右。

3投稿注意事項 投稿時請務(wù)必在稿件末頁留下第一作者手機號碼和電子郵箱地址，同時附上單位證明（證明該病例所有資料屬實，無一稿兩投，無涉及保密等情況）。

本刊編輯部

Protective effects of Chinese medicine Tongxinluo on cerebral ischemia reperfusion injury in mice

ZHENG Chaobo，LIU Jianrong.
Department of Neurology,Rui Jin Hospital Jiao Tong University School of Medcine,Shanghai 200025,China

Tongxinluo Cerebral ischemia Inflammatory cytokines IL-6 IL-1β TNF-α

2014-12-08）

200025 上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（鄭超波、劉建榮，鄭超波現(xiàn)在浙江醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科工作）