張財明 季一鳴 朱敏 呂尚東 王愛東

Livin shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及在胰腺癌細(xì)胞的效應(yīng)研究

張財明 季一鳴 朱敏 呂尚東 王愛東

目的 構(gòu)建Livin shRNA真核表達(dá)載體，探討干擾質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的胰腺癌panc-1細(xì)胞系效應(yīng)。方法 合成Livin基因干擾序列并定向插入到RNA干擾（RNAi）真核表達(dá)載體pGCsilencerTM U6/Neo/GFP/RNAi質(zhì)粒，通過測序進(jìn)行鑒定。干擾質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染panc-1細(xì)胞。經(jīng)G418持續(xù)壓力選擇和有限稀釋法獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。定量RT-PCR檢測所篩選克隆Livin mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，采用western blot驗證Livin蛋白表達(dá)水平改變。結(jié)果 測序證明Livin干擾序列及讀碼框正確，干擾質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的panc-1細(xì)胞在倒置熒光顯微鏡下呈明亮綠色熒光，定量RT-PCR和western blot檢測結(jié)果顯示Livin shRNA序列對胰腺癌細(xì)胞系Livin mRNA及蛋白表達(dá)均有抑制作用。結(jié)論 成功構(gòu)建Livin shRNA真核表達(dá)載體，建立Livin shRNA質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的panc-1細(xì)胞系可為進(jìn)一步研究Livin在胰腺癌細(xì)胞中的作用奠定基礎(chǔ)。

Livin基因 RNA干擾 轉(zhuǎn)染 panc-1細(xì)胞

Livin基因又名KIAP/ML-IAP基因，定位于染色體20q13.3，是一個新近發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制基因（inhibitor of apoptosis protein，IAP），屬于IAP家族中一個重要的成員，其意義接近于survivin基因，其在腫瘤細(xì)胞抗凋亡機(jī)制和耐藥機(jī)制的形成中都有重要意義。本研究探討Livin shRNA序列對胰腺癌細(xì)胞系中Livin基因的抑制作用，為以Livin基因為靶點的腫瘤基因治療提供實驗依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 小干擾（siRNA）干擾片段和引物由捷瑞公司（上海）合成，限制性內(nèi)切酶SalⅠ、BamHⅠ和HindⅢ、T4 DNA連接酶、脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，pGCsilencerTM U6/Neo/GFP/RNA干擾（RNAi）載體購自Promega公司，無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒購自O(shè)MEGA公司、Livin多克隆抗體購自GeneTex公司，GAPDH為杭州賢至生物公司產(chǎn)品，ECL prime為美國GE公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 shRNA設(shè)計和重組體的構(gòu)建 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫Livin基因序列（NM-022161），參考siRNA的設(shè)計原則（siRNA的結(jié)構(gòu)為BamHI+sense+Loop+Antisense+終止信號+HindⅢ）。設(shè)計Livin RNAi打靶序列3條，其中Livin-1為5′-CAGGCCATCAGGACAAGGT-3′；Livin-2為5′-GGAAGAGACTTTGTCCACA-3′；Livin-3為5′-GGAGAGAGGTCCAGTCTGA-3′。在sense與antisense序列中間為9個插入序列TTCAAGAGA，形成發(fā)夾環(huán)，并在寡核苷酸片段的5′和3′端引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點，使其能與pGCsilencerTM U6/ Neo/GFP/RNAi載體連接。用30μl退火溶液溶解合成的2 OD DNA單鏈合成片段，94℃水浴退火，自然冷卻至室溫。1%瓊脂糖凝膠回收大片段，稀釋退火片段Livin，分別與線形化pGCsilencerTM U6/Neo/GFP/RNAi質(zhì)粒表達(dá)載體連接。各取5μl過夜連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a，分別涂布于含氨芐抗性（終濃度為100ng/μl）的LB平板上，37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜。從每個培養(yǎng)皿上各挑取3個單克隆菌落接種于3ml含氨芐抗性（終濃度為100ng/μl）的LB培養(yǎng)液中，37℃恒溫?fù)u床（250r/min）培養(yǎng)過夜。用質(zhì)粒小量抽提試劑盒小量提取質(zhì)粒，將鑒定證實后的細(xì)菌培養(yǎng)擴(kuò)增，取1管送上海桑尼生物公司測序驗證。

1.2.2 panc-1細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及熒光顯微鏡觀察將5×104細(xì)胞種植于6孔板，培養(yǎng)16h，待細(xì)胞融合率達(dá)70%時，將0.8μg RNAi干擾質(zhì)粒和2μl Lipofectamine 2000分別加至50μl無血清DMEM（高糖）培養(yǎng)液中，輕輕搖勻，5min后將兩者混勻，室溫放置15min，再將其加入PBS漂洗后的panc-1細(xì)胞，邊加邊輕輕混合，轉(zhuǎn)染混合液總體積為2ml。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞置37℃、5%CO2的孵箱中孵育6h后棄去轉(zhuǎn)染液，加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)至24h，收集部分細(xì)胞，用于總RNA抽提。另取部分細(xì)胞按1∶10稀釋，將其轉(zhuǎn)種于另一培養(yǎng)板，再經(jīng)過24h后，向培養(yǎng)液中加入終濃度為500μg/ml的G418進(jìn)行抗性篩選，1周后熒光顯微鏡下可見有細(xì)胞克隆發(fā)出熒光，對陽性克隆進(jìn)行有限稀釋，擴(kuò)大培養(yǎng)后獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。

1.2.3 定量RT-PCR檢測所篩選克隆Livin mRNA的表達(dá) 取Trizol試劑提取的細(xì)胞總RNA 2μg，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以野生型panc-1細(xì)胞為對照。Livin基因引物F：5′-ATGGGACCTAAAGACAGTGCC-3′；引物F：5′-GCGGCCAGTCATAGAAGGAG-3′；β-actin引物F：5′-AAGATGACCCAGATCATGTTTGA-3′；引物R：5′-TTAATGTCACGCACGAT-TTCC-3′，由上?；瞪锕竞铣?，取0.1μg cDNA作模板，分別擴(kuò)增Livin和β-actin基因。20ul體系含cDNA 0.1μg、10μM/L上游和下游引物、2×Faststart universal SYBR Green Master（含Rox）10μl，滅菌雙蒸水補足至20μl。擴(kuò)增程序為：預(yù)變性95℃2min；95℃15s、60℃1min，40個循環(huán)；最后作溶解曲線分析，95℃ 15s、60℃ 1min，95℃ 15s、60℃15s。用ABI7300進(jìn)行PCR擴(kuò)增和分析。

1.2.4 Western blot鑒定Livin shRNA沉默效果 取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RNAi-Livin建系的panc-1細(xì)胞系對數(shù)生長期細(xì)胞，抽提總蛋白，以野生型panc-1細(xì)胞為對照。取各組細(xì)胞抽提蛋白10μg，加適量5×上樣緩沖液，經(jīng)煮沸變性后，行10%SDS-PAGE電泳（80V，120min），切取含目的蛋白凝膠，轉(zhuǎn)膜15V，25min。用含3%BSA的PBST 4℃封閉過夜，Livin抗體（1∶2 000），GAPDH多抗（1∶1 000）4℃標(biāo)記過夜，PBST洗滌5次后，標(biāo)記二抗（1∶10 000），洗膜后，ECL顯色，曝光，顯影并定影，成像分析。

2 結(jié)果

2.1 重組Livin shRNA真核表達(dá)載體的測序結(jié)果 見圖1。

由圖1可見，所獲得的重組干擾質(zhì)粒目的片段與預(yù)期相符，表明退火形成的干擾寡核苷酸成功連接入pGCsilencerTM U6/Neo/GFP/RNAi載體。

2.2 重組shRNA載體轉(zhuǎn)染panc-1細(xì)胞后熒光顯微鏡下觀察所見 見圖2。

由圖2可見，由于pGCsilencerTM U6/Neo/GFP/ RNAi載體帶有綠色熒光報告基因，因此，干擾載體pGCsilencerTM U6/Neo/GFP/RNAi-Livin shRNA轉(zhuǎn)染成功的panc-1細(xì)胞會發(fā)出綠色熒光，表明panc-1細(xì)胞中有轉(zhuǎn)染的外源基因表達(dá)。

2.3 定量RT-PCR檢測結(jié)果 見圖3。

由圖3可見，siRNA-Livin干擾序列對胰腺癌panc-1細(xì)胞Livin mRNA有抑制作用，尤其是打靶序列Livin-1的沉默效果與野生型panc-1細(xì)胞差異明顯，而打靶序列Livin-2和Livin-3對其mRNA轉(zhuǎn)錄水平無明顯抑制效應(yīng)。

2.4 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平結(jié)果 見圖4。

由圖4可見，野生型panc-1細(xì)胞Livin蛋白呈陽性表達(dá)，經(jīng)導(dǎo)入外源性shRNA-Livin-1后，其蛋白表達(dá)水平明顯下降。

3 討論

胰腺癌是一種高度惡性的消化道腫瘤，其發(fā)病率近幾年來呈上升趨勢。在美國，胰腺癌占消化道腫瘤患者死亡原因的第2位；在我國，近20年來其發(fā)病率也增加了約40%。胰腺癌病情隱匿，早期癥狀不典型，發(fā)展迅速，具有高度侵襲性，預(yù)后差，大多數(shù)患者確診時已屬晚期，手術(shù)切除率較低，5年生存率低于4%。胰腺癌對現(xiàn)有的化療、放療及免疫治療效果也均不理想，迫切需要尋找新的治療手段。隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展，胰腺癌的基因治療已經(jīng)在多個方面取得了突破性進(jìn)展，已成為治療腫瘤的希望所在。研究表明胰腺癌的發(fā)生涉及到多種癌基因、抑癌基因、生長因子、細(xì)胞黏附因子及DNA修復(fù)基因等的異常和積累，基因治療有可能成為胰腺癌治療的發(fā)展方向。

圖1 重組Livin shRNA真核表達(dá)載體測序圖（A、B、C分別為Livin-1、Livin-2和Livin-3的siRNA序列）

圖2 重組shRNA載體轉(zhuǎn)染panc-1細(xì)胞后熒光顯微鏡下觀察所見[A：重組shRNA載體轉(zhuǎn)染panc-1細(xì)胞后24h（×100）；B：重組shRNA載體轉(zhuǎn)染panc-1細(xì)胞后陽性克隆細(xì)胞培養(yǎng)（×100）]

圖4 Western blot檢測胰腺癌細(xì)胞panc-1轉(zhuǎn)染前后Livin蛋白表達(dá)差異（1：未轉(zhuǎn)染組；2：轉(zhuǎn)染組）

圖3 定量RT-PCR檢測結(jié)果

RNAi技術(shù)是近年發(fā)展的一項特異性抑制基因表達(dá)的新方法，是雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞或通過載體在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄成具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA，能夠高效特異地剔除同源基因表達(dá)，形成相應(yīng)的功能缺陷表型的一種技術(shù)，其機(jī)制是RNAi在真核細(xì)胞中的發(fā)生過程是通過一個被稱之為Dicer的酶，將dsRNA裂解成21-25核苷酸的siRNA。siRNA變成細(xì)胞內(nèi)RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體的一部分，該復(fù)合物通過互補靶定將要降解的細(xì)胞內(nèi)的mRNA，最終將細(xì)胞中的基因表達(dá)阻斷，隨著對siRNA研究的不斷深入，越來越多的研究顯示siRNA在基因治療的潛在優(yōu)勢。與其他幾種基因封閉技術(shù)相比，siRNA具有更強(qiáng)大、更持久的抑制基因表達(dá)的能力，其效能是反義寡核苷酸100～10 000倍[1]；siRNA具有序列特異性高、無免疫原性及體積小等優(yōu)點，這就為治療癌癥這類由于多基因表達(dá)失調(diào)導(dǎo)致的疾病提供了可能[2]。利用RNAi技術(shù)沉默特定基因，可實現(xiàn)快速、高效、個體化的基因治療，在疾病的基因治療上有廣闊的應(yīng)用前景[3]。采用RNAi技術(shù)在膀胱癌、乳腺癌、白血病、原發(fā)性肝癌等人類腫瘤細(xì)胞株體外﹑體內(nèi)抑制實驗中均己獲得了成功[4-5]。

凋亡不足是惡性腫瘤對化學(xué)治療及放射治療產(chǎn)生耐受的重要因素，因為許多抗腫瘤治療是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡實現(xiàn)的。如何抑制抗凋亡基因的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，是目前腫瘤靶向治療的新方向。Livin是最近發(fā)現(xiàn)的IAP家族的新成員，在正常成人的大多數(shù)終末組織中（除胎盤）表達(dá)極低，甚至不表達(dá)，但在胎兒發(fā)育過程中，多種組織以及多數(shù)惡性腫瘤中高表達(dá)。大量研究資料表明，Livin在惡性腫瘤組織中異常高表達(dá)且不存在組織特異性，惡性黑色素瘤、鼻咽癌、肺癌、膀胱癌、宮頸癌、乳腺癌、淋巴瘤等癌組織均可高表達(dá)[6-8]。國外研究者使用具有靶向作用的siRNA干涉內(nèi)源性Livin基因的表達(dá)，使Livin基因沉默而不表達(dá)蛋白，在使用阿霉素、紫外線照射以及TNF等凋亡促進(jìn)劑治療后，凋亡率大大增加[9-10]。上述研究表明，通過抑制Livin能顯著提高腫瘤細(xì)胞對促凋亡刺激的敏感性，抑制其表達(dá)可望成為治療惡性腫瘤的新方法。

在本實驗中，我們針對Livin基因的編碼區(qū)設(shè)計了shRNA序列，采用RNA干擾技術(shù)，成功構(gòu)建了能在真核細(xì)胞中表達(dá)Livin shRNA序列的載體，并導(dǎo)入胰腺癌細(xì)胞，建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的panc-1細(xì)胞系，同時通過定量RT-PCR檢測顯示該RNAi-Livin干擾序列能有效沉默胰腺癌panc-1細(xì)胞Livin基因的表達(dá)，為以Livin基因為靶點的胰腺癌基因治療提供了重要的實驗依據(jù)。

[1] Caplen N J.Gene Therapy Progress and Prospects Downregulating gene expression:the impact of RNA interference[J].Gene Therapy,2004,11(16):1241-1248.

[2] 馬鵬鵬,薛社普,韓代書.RNA干擾技術(shù)的原理和應(yīng)用[J].中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2003,12(2):201-207.

[3] Kim D,Rossi J.RNAi mechanisms and applications[J].Biotechniques,2008,44（5）:613-616．

[4] Zhang P H,Zou L,Tu Z G.RNAi-hTERT inhibition hepatocellular carcinoma cellproliferation via decreasing telomerase activity[J].J Surg Res,2006,131(1):143-149.

[5] Subramanian R,GondiC S,Lakka S S,et al.siRNA-mediated simultaneous downregulation of uPA and its receptor inhibits angiogenesis and invasiveness triggering apoptosis in breast cancer cells[J].Int J Oncol,2006,28(4):831-839.

[6] Wang H,Tan S S,Wang X Y,et al.Silencing livin gene by siRNA leads to apoptosis induction,cell cycle arrest,and proliferation inhibition in malignant melanoma LiBr cells[J].Acta Pharmacolgica Sinica,2007,28(12):1968-1974.

[7] Xiang Y,Yao H,Wang S,et al.Prognostic value of Survivin and Livin in nasopharyngeal carcinoma.Laryngoscope[J].2006,116 (1):126-130.

[8] Liu XK,Liu H B,Kong C Z.Effects ofgene Livin transfection affect on the apoptosis in bladder carcinoma cells[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2008,88(12):853-855.

[9] Crnkovic -Mertens I,Semzow J,Hoppe-Seyler F,et al.Isoform-specific silencing ofthe Livin gene by RNAinterference defines Livin beta as key mediator of apoptoais inhibition in Hel,a cells[J].J MolMed,2006,84(3):232-240．

[10] Crnkovic -Mertens I,Wagener N,Semzow J,et al.Targeted inhibition of Livin resensitizes renal cancer cells towards apoptosis [J].CellMolLife Sci,2007,64（9）:1137-1144．

Construction of LivinshRNA vector and its effect on expression of Livin mRNA and protein in pancreatic cancer cells

ZHANG Caiming，JI Yiming，ZHU Min，et al.
Department of Hepatobiliary Surgery，Taizhou Hospital of Zhejiang Province,Taizhou 317000, China

【 Abstract】 Objective To construct LivinshRNA eukaryotic expression vectors and to investigate its effect on expression of Livin mRNA and protein in pancreatic cancer cell line panc-1. Methods Livin gene interference sequence was synthesized and inserted into pGCsilencerTM U6/Neo/GFP/RNAi vector，which was confirmed by sequencing.The recombinant RNAi vector was transfected into pancreatic cancer panc-1cells by Lipofectamine 2000.The cells containing stable transformants were selected by G418,and isolated with limited dilution.The mRNA expression of Livin in the selected clones was detected by RT-PCR,the protein expression of Livin was detected by Western blot. Results The successful construction of RNAi eukaryotic expression vectors targeting Livin was confirmed by sequencing,which was expressed in panc-1 cells after transfection as showed by green fluorescence under inverted fluorescence microscope.RT-PCR and Western blot revealed that the expression of Livin mRNA and protein was down-regulated in panc-1 cells. Conclusion Livin shRNA eukaryotie expression vector was successfully constructed and the transfected pancreatic cancer panc-1 cells show a down-regulated expression of Livin mRNA and protein．

Livin gene RNA interference Transfection panc-1 cell

2014-07-11）

（本文編輯：楊麗）

臺州市科技局計劃項目（102KY09）

317000 臺州恩澤醫(yī)療中心（集團(tuán)）浙江省臺州醫(yī)院肝膽外科

季一鳴，E-mail：jiymjiym@163.com