聶良明 張慧 王曉明 許林海

心肌球樣細(xì)胞的生物來源及治療心力衰竭潛在作用的實(shí)驗(yàn)研究

聶良明 張慧 王曉明 許林海

目的 探討心肌球樣細(xì)胞（CDCs）在心力衰竭治療中的應(yīng)用前景。方法 Wistar雄性大鼠24只，無菌下取大鼠心臟組織通過膠原酶消化，培養(yǎng)取得CDCs，采用體外培養(yǎng)連續(xù)傳代（P1～P5），鏡下觀察可見CDCs團(tuán)形成。采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表型，并連續(xù)觀察CDCs的自我更新和心肌細(xì)胞分化能力，并用免疫組化檢測CDCs中的肌鈣蛋白（cTnT）的表達(dá)。結(jié)果CDCs體外呈指數(shù)生長并形成細(xì)胞團(tuán)樣結(jié)構(gòu)，流式細(xì)胞儀檢測顯示：CD29、CD44、CD90和CD106為陽性，而CD34、CD45為陰性。CDCs表達(dá)了心肌細(xì)胞特異性的結(jié)構(gòu)蛋白cTnT，并可在體外培養(yǎng)條件下產(chǎn)生自主搏動。結(jié)論 CDCs是具有心肌細(xì)胞分化潛能及臨床應(yīng)用前景的細(xì)胞供體。

心肌球樣細(xì)胞（CDSs） 細(xì)胞治療 心力衰竭

心力衰竭病死率很高，現(xiàn)有的醫(yī)療手段雖然可以有效改善心臟功能，但仍不能防止病情的進(jìn)一步惡化。心力衰竭的治療除了心臟移植以外，其他手段無法補(bǔ)償缺失的功能性心肌[1]。盡管心臟本身具有自我更新和修復(fù)的能力，但這種內(nèi)源性的修復(fù)能力不足以代償諸如心肌大面積壞死引起的心肌細(xì)胞喪失[2]。心源性干細(xì)胞（cardiac stem cells，CSCs）與心臟組織相容性良好，因此可以更好地整合到心肌組織當(dāng)中[3]。對此，我們在臨床開展心臟移植的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過動物實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞供體的角度，研究心肌球樣細(xì)胞（cardiospherederived cells，CDCs）的干細(xì)胞生物學(xué)特性以及其在體外擴(kuò)增以后的更新能力和心肌細(xì)胞分化潛能，探討CDCs作為細(xì)胞供體用于治療心力衰竭的可能，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動物：Wistar雄性大鼠24只，體重200～300g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。（2）麻醉藥品和抗凝藥：異氟烷，鹽酸氯胺酮，氟哌利多、萬可松、肝素鈉（美國Sigma公司）。（3）實(shí)驗(yàn)試劑：小鼠抗肌鈣蛋白（cTnT）多克隆抗體、兔抗c-kit和cTnT多克隆抗體（均由美國Santa Cruz公司）；TRITC和FITC標(biāo)記的羊抗兔抗血清（德國Dako公司）。（4）手術(shù)器材和實(shí)驗(yàn)儀器：手術(shù)顯微鏡（鎮(zhèn)江中天公司，XTS-4A型），冷凍切片機(jī)（德國Microm公司，HM315R型），熒光顯微鏡（日本Olympus公司，IX71型）。

1.2 免疫組化檢測 CO2窒息法處死動物，開胸取心臟清洗后用組織包埋液在-40～-30℃速凍成組織包塊，快速切片，厚度7μm。1%冷多聚甲醛固定后，分別作HE染色和間接免疫熒光染色。免疫組化檢測切片先用羊血清封閉30min，加入一抗（抗c-kit）置側(cè)擺搖床室溫下孵育2h，然后用PBS洗去一抗，洗滌3次后加入二抗并孵育1h，最后4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色看到標(biāo)記細(xì)胞核，洗滌后用Fluormount封片，熒光顯微鏡數(shù)碼成像。

1.3 CDCs的分離、培養(yǎng) CO2窒息法處死大鼠，75%乙醇浸泡3min。無菌操作下剪開大鼠腹部；沿肋骨邊緣將隔膜小心剪開，打開胸腔。取出心臟清洗后，將心肌組織充分剪碎，再用PBS洗去脂肪滴，加入3倍體積的膠原酶，吹勻后轉(zhuǎn)移到15ml的離心管中；37℃水浴中消化30min（每隔5min取出充分搖勻），100目濾網(wǎng)過濾；FicollR400梯度離心，棄上清液，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液（低糖DMEM培養(yǎng)液、30%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、2mmol/L谷氨酰胺，pH 7.2）重懸細(xì)胞，接種到T25培養(yǎng)瓶中；第3天進(jìn)行觀察換液，棄未貼壁細(xì)胞，之后換液1次/3d；細(xì)胞鋪滿瓶底70%～80%時，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，0.04ml/cm2）消化后傳代，傳代比例為1∶3，標(biāo)記為第一代細(xì)胞（P1），之后換液1次/3d，細(xì)胞近單層融合時傳代，分別標(biāo)記為Pn（n=1、2、3……）。

1.4 CDCs的自我更新能力測定 取分離的原代細(xì)胞，通過體外連續(xù)傳代，分析觀察傳代細(xì)胞形成克隆樣結(jié)構(gòu)的數(shù)目，以此表明其自我更新能力，培養(yǎng)傳代。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測CDCs表面標(biāo)記 取P3細(xì)胞，待細(xì)胞生長至90%鋪滿時，用0.25%胰蛋白酶消化分離，離心后用PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3.0×106/ml。根據(jù)需要，將100μl細(xì)胞懸液分裝于2ml離心管，并按量于各個樣品管內(nèi)加入相對應(yīng)的抗體，包括：CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105（1∶100～200稀釋）。4℃避光孵育30min后，于每樣品管內(nèi)添加2ml PBS，離心后棄上清液，分離游離抗體。最后，每樣品管加入500μl PBS，重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測。

1.6 CDCs中cTnT表達(dá)測定 將P3的CDCs接種于細(xì)胞培養(yǎng)玻片中，3d后作免疫組化染色。培養(yǎng)玻片先抽去培養(yǎng)液，用1%冷多聚甲醛固定后用羊血清封閉30min，加入一抗（cTnT）置側(cè)擺搖床室溫下孵育2h，然后用PBS洗去一抗，洗滌3次后加入二抗并孵育1h，最后作DAPI染色，洗滌后用Fluormount封片，熒光顯微鏡下數(shù)碼成像。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心臟組織免疫組化檢測結(jié)果 見圖1。

圖1 大鼠心臟組織免疫組化檢測結(jié)果（圖中箭頭示c-kit陽性細(xì)胞，右下標(biāo)記示100μm）。

由圖1可見，大鼠心肌組織中部分間質(zhì)細(xì)胞呈ckit陽性染色，以c-kit為特征的陽性細(xì)胞普遍存在于大鼠心肌組織中，提示成年大鼠心臟中富含c-kit陽性為特征的CSCs。

2.2 CDCs的培養(yǎng)和自我更新能力 見圖2。

圖2 CDCs傳代培養(yǎng)結(jié)果（圖中箭頭示c-kit陽性細(xì)胞，左下標(biāo)記示100μm）。

由圖2所見，觀察傳代后CDCs的形態(tài)和形成心肌球樣結(jié)構(gòu)的能力，結(jié)果顯示，CDCs在反復(fù)傳代以后，分離培養(yǎng)的CDCs在體外連續(xù)傳代至P5，同樣可以形成心肌球樣結(jié)構(gòu)，大約每低倍視野（×10）中（6.82± 2.96）個細(xì)胞團(tuán)，表明CDCs具有連續(xù)自我更新能力。

2.3 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果 見圖3。

由圖3可見，CDCs體外培養(yǎng)3代后，CD29、CD44、CD90、CD105陽性，CD34、CD45陰性，表明分離的細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。

2.4 CDCs免疫組化分析結(jié)果 見圖4。

由圖4可見，用免疫組化的方法檢測傳代后的CDCs（P5），發(fā)現(xiàn)傳代以后的CDCs在常規(guī)的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞團(tuán)中心的部分細(xì)胞已經(jīng)呈cTnT陽性染色（圖4A），并可以分化成自主搏動的細(xì)胞（圖4B）。cTnT是心肌細(xì)胞特異性的結(jié)構(gòu)蛋白，僅表達(dá)于成熟心肌和心肌前體細(xì)胞。CDCs呈cTnT陽性染色，表明CDCs是心肌細(xì)胞的前體細(xì)胞，具有比較強(qiáng)的分化成成熟心肌細(xì)胞潛能。

圖3 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果

圖4 CDCs免疫組化分析結(jié)果（A：藍(lán)色為DAPI細(xì)胞核染色；B：箭頭所指分化成自主搏動的細(xì)胞；左下標(biāo)示為100μm。）

3 討論

心力衰竭目前有效的治療手段為心臟移植，但由于心臟供體的短缺，心臟移植的大規(guī)模臨床應(yīng)用在很大程度上受到了限制。再生醫(yī)學(xué)研究的科學(xué)家們目前正在致力于細(xì)胞移植技術(shù)，修復(fù)和改善由于心肌損傷后的心功能不良[2]。最近研究表明，心臟本身具有自我更新和修復(fù)能力，其再生和修復(fù)過程與內(nèi)源性的CSCs有關(guān)[4]。但這種內(nèi)源性的修復(fù)能力不足以代償諸如心肌大面積壞死引起的心肌細(xì)胞喪失[2]。目前，科學(xué)家們正在探究如何刺激心臟本身的內(nèi)源性的修復(fù)能力，促進(jìn)損傷心肌的修復(fù)和再生。

干細(xì)胞是指還沒有完全發(fā)育為成體細(xì)胞、具有演變成特定器官潛力的細(xì)胞。由于心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，無法進(jìn)入細(xì)胞周期，缺乏自我更新能力[5]。近十年來，隨著干細(xì)胞定向心肌細(xì)胞分化技術(shù)的成熟，通過心肌成形術(shù)手段修復(fù)損傷心肌成為治療缺血性心臟病最有前景的治療方法之一[2]。然而，細(xì)胞供體的選擇很大程度上直接影響到細(xì)胞治療的質(zhì)量。早期開展的胚胎干細(xì)胞和最近發(fā)現(xiàn)的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞由于其倫理學(xué)問題和分化成畸胎瘤的危險性以及這些細(xì)胞的免疫排斥反應(yīng)，很大程度上制約了進(jìn)一步的臨床應(yīng)用[5]。目前正在實(shí)施的干細(xì)胞治療缺血性心臟病的臨床試驗(yàn)，主要采用自體的骨髓干細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞。多中心的Meta分析顯示，細(xì)胞治療僅有微弱心功能改善效果，其主要問題是這些非心源性成體干細(xì)胞在心臟中的低成活率[6]。因此，選擇合適的供體細(xì)胞來源，直接影響到細(xì)胞治療的臨床療效。

CDCs可能是心血管系統(tǒng)在胚胎發(fā)育過程中第二心區(qū)殘留的特殊細(xì)胞群，是一種特殊的CSCs。心臟第二心區(qū)的細(xì)胞主要來源于流出道附近，進(jìn)一步遷移至室間隔和心室表層，發(fā)育成心外膜，冠脈系統(tǒng)和部分心外膜下心肌[3，7]。當(dāng)心臟發(fā)育成熟以后，這些細(xì)胞可以會繼續(xù)存在于成體心臟的細(xì)胞間質(zhì)中。因?yàn)镃DCs代表了心臟組織的內(nèi)源性的修復(fù)和再生能力，當(dāng)心肌損傷時，CDCs可能參與心機(jī)損傷以后的自我更新和修復(fù)作用。因此，通過體外擴(kuò)增手段，就可以放大心臟的修復(fù)能力，通過細(xì)胞移植技術(shù)，補(bǔ)充缺失的心肌細(xì)胞，改善心功能[2]。我們通過消化分離CDCs，并用流式細(xì)胞儀分析這些細(xì)胞的的免疫表型，發(fā)現(xiàn)CDCs與機(jī)體的其他組織的骨髓基質(zhì)細(xì)胞（MSC）有很大的類似，比如，CDC和MSC都是CD90和CD105陽性細(xì)胞群，CDCs并不是一種單一的細(xì)胞群，同時也可能是c-kit陽性，也可能是sca-1和flk-1陽性細(xì)胞。利用這些細(xì)胞表面的標(biāo)記蛋白，可以成功分離和純化心肌組織中的CDCs[8]。Chong等[9]在2011年進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明了確定CDCs是心臟固有的干細(xì)胞，并可以形成成纖維細(xì)胞樣克隆樣結(jié)構(gòu)（CFU-FS），并具有多向分化的細(xì)胞潛能。

自從CDCs被發(fā)現(xiàn)以來，其心源性和組織兼容性受到了廣泛的重視，并已經(jīng)開展了大量的動物實(shí)驗(yàn)研究[10-12]。由于CDCs是心臟組織中特有的間質(zhì)干細(xì)胞，因此，CDCs的自我更新能力是體外培養(yǎng)擴(kuò)增的必要前提。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從心臟組織活檢標(biāo)本中獲得的CDCs可以在體外連續(xù)傳代，并具有自我更新能力（形成CDCs細(xì)胞團(tuán)）。這一生物學(xué)特征，可以滿足將來臨床應(yīng)用的條件，即從小塊心肌活檢組織中分離心臟干細(xì)胞，并在體外擴(kuò)增至臨床治療的數(shù)量級的細(xì)胞數(shù)（大約108個細(xì)胞）。最主要的是，CDCs經(jīng)過連續(xù)傳代以后，其心肌細(xì)胞的分化潛能并沒有改變。因此，結(jié)合以往的在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)為將來利用CDCs治療缺血性心臟病和心力衰竭提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。動物實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果同時推動了CDCs的進(jìn)一步臨床研究，目前《Lancet》雜志分別發(fā)表了兩項(xiàng)評估自體CDCs冠狀動脈內(nèi)注射的可行性和安全性研究成果（代號分別為SCIPIO和CADUCEUS）[10，13]。美國加州和肯塔基州的兩個研究團(tuán)隊(duì)分別通過導(dǎo)管技術(shù)獲得患者的心房和心室的組織標(biāo)本，通過體外分離培養(yǎng)，獲得純化的CDCs細(xì)胞，并進(jìn)一步擴(kuò)增后，再注射到患者的梗死心肌區(qū)域（其中SCIPIO有16例患者，CADUCEUS有17例患者）。研究結(jié)果顯示，CDCs細(xì)胞移植可以減少心肌梗死以后的瘢痕形成，改善心臟的收縮功能。但是由于這些研究都是小樣本并缺乏有效的對照患者，所以，CDCs的臨床研究需要大樣本和多中心的進(jìn)一步研究。

CDCs可以從心臟組織活檢標(biāo)本中獲得，可以準(zhǔn)備患者特異性的干細(xì)胞供體，減少免疫排斥反應(yīng)。由于CDCs具有自我更新能力，可以在體外擴(kuò)增至臨床應(yīng)用的數(shù)量級的細(xì)胞數(shù)。同時，CDCs具有較其他來源的干細(xì)胞（例如骨髓干細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞）擁有更好的心臟組織相容性。因此，CDCs是一種非常有實(shí)際臨床意義的細(xì)胞供體來源；不過，治療心力衰竭的臨床療效仍然需要進(jìn)一步的研究。

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Biological origin of cardiosphere-derived cells and their therapeutic potential for heart failure

NIE Liangming,ZHANG Hui,WANG Xiaoming,et al.
Department of Cardiothoracic Surgery,Zhejiang Provincial People's Hospital,Hangzhou 310014,China

【 Abstract】 Objective To investigate the differentiation potential of cardiosphere-derived cells(CDCs)after expansion in vitro.Methods CSCs were isolated by enzymatic digestion of cardiac issue from 24 Wistar rats and their immunological phenotypes were analyzed by using FACS and immunohistological staining.After expansion up to 5th passage,the ability of self-renewal and myogenic potential were analysed. Results The isolated cardiac stem cells(CSCs) grew exponentially and exhibited a similar morphology to cardiosphere.FACS analysis revealed positive for CD29,CD44, CD90,CD106and negative for CD34,CD45.Small fractions of CSCs were undergoing myogenic differentiation,evidenced by the expression of cardiac structural proteins(cTnT)and developing spontaneous contraction. Conclusion CDCs retain myogenic potential after in vitro expansion and thus may be used as donor cells for cardiac plasticity.

Cardiosphere-derived cells Cell therapy Heart failure

2014-09-02）

（本文編輯：楊麗）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013KYA021）

310014 杭州，浙江省人民醫(yī)院心胸外科（聶良明、許林海），手術(shù)室（張慧）；南京明基醫(yī)院心胸外科（王曉明）