■彭思源 王學東 李 彪 胡先勤龔阿瓊 鄭紅生 何林玲

（1.武漢輕工大學，湖北武漢 430023；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003；3.武漢永生鴨業(yè)有限公司，湖北武漢 430077）

從微生物防控角度預防疾病，利用有益菌治療致病菌的原理控制預防疾病的發(fā)生，從而減少養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的用藥是其中最關(guān)鍵一環(huán)。熱休克蛋白（Hot shock protein，Hsp）通常被稱為應激蛋白或蛋白分子伴侶[1]。它是一切有生命細胞遇短暫高溫、缺氧、亞砷酸鹽及H2O2等應激原刺激時所發(fā)生的一種以基因表達和調(diào)控變化為特征的細胞應激反應[2]。根據(jù)Hsp的相對分子質(zhì)量，主要的Hsp被分成6個家族：大分子量Hsp家族、Hsp90家族、Hsp70家族、Hsp60家族、小分子量Hsp家族和泛素[3-4]。其中熱激蛋白的累積與細胞耐熱性的提高具有密切相關(guān)性，如Lindquist等[5]發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)大量表達的Hsp104對酵母的耐熱性大大提高具有積極作用。Hsp70的細胞保護作用是指機體細胞在收到各種應激、如高溫，氧化等有害應激時，產(chǎn)生的Hsp70可以增強細胞對損害的耐受程度，維持細胞的正常功能代謝，提高細胞生存率[6]。幾乎所有的細胞均能合成熱休克蛋白，其中Hsp70家族含量最多亦最重要。目前認為Hsp70具有多種功能，是一種非特異性細胞保護蛋白，因此備受關(guān)注[2]。本試驗旨在從肉鴨消化道內(nèi)分離篩選出5株釀酒酵母中，通過熱激處理選取最有高抗性的菌株，并探究溫度與酵母菌株胞內(nèi)熱休克蛋白的相關(guān)性，本研究為開發(fā)高抗性、專一型的酵母益生菌制劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

本實驗室從肉鴨腸道分離保存的5株釀酒酵母。

1.1.2 培養(yǎng)基

瓊脂培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基均為國產(chǎn)。

1.1.3 試劑

0.5 mol/l Tris-HCl pH值6.8、10%SDS(BIOSHARP)、0.1%溴酚藍（BIOSHARP）、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（BEYOTIME）、marker(THERMO)、0.25%考馬斯亮藍R-250（BIOSHARP）;β-巰基乙醇、甘油等均為國產(chǎn)。

1.1.4 儀器設備（公司名稱）

單人單面凈化工作臺（SW-CJ-1FD，蘇州凈化設備有限公司）、恒溫恒濕培養(yǎng)箱（LRHS-150-Ⅱ，上海躍進醫(yī)療器械有限公司）、恒溫培養(yǎng)振蕩器（HNY-200B，天津市歐諾儀器儀表有限公司）、手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器（YX280A，上海三申醫(yī)療器械有限公司）、高壓均質(zhì)機（AH-2010，ATS Engineering Limited）、電泳儀（PowerPac，BIO-RAD）、凝膠成像儀（Gel DocTMEZ，BIO-RAD）、離心機（TDZ5-WS，平凡儀器）、超聲波儀（UWave-1000，新儀）、超純水系統(tǒng)（Milli-Q Intergral，美國Millipore密理博）、醫(yī)用低溫保存箱（DW-40L188，青島海爾特種電器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母菌的培養(yǎng)

將5株釀酒酵母分別接種于YPD培養(yǎng)基中，28℃、160 r/min 2次培養(yǎng)（以獲得第二代酵母細胞）至對數(shù)期（107～108個/ml）[7]。

1.2.2 酵母菌超聲波法破壁[8]

稱取適量酵母泥，加入0.5 mol/l Tris-HCl pH值6.8，按料液比1∶3，制成酵母懸液，設定功率300 W，于冰浴條件下進行超聲破碎30 min（設定工作5 s，間隔10 s）。

1.2.3 酵母菌凍融法破壁[8]

稱取適量酵母泥，加入0.5 mol/l Tris-HCl pH值6.8，按料液比1∶3制成酵母懸液，分別于-20℃冰箱中反復凍融3～5次，每次冷凍時間2 h，100℃水浴中解凍20 min。

1.2.4 酵母菌高壓均質(zhì)機破壁

稱取適量酵母泥，加入0.5 mol/l Tris-HCl pH值6.8，按料液比1∶3制成酵母懸液[9]，均質(zhì)壓力調(diào)整為140 MPa，經(jīng)2～3次循環(huán)。

1.2.5 酵母菌染色

用呂氏堿性美蘭進行染色，破壁的酵母呈蘭紫色，而未破壁的酵母呈無色透明，分別計數(shù)，并采用相同的稀釋度用血球記數(shù)板進行鏡檢記數(shù)。計算破壁率。破壁率的計算公式：

式中：α——破壁率（%）；

c——破壁前的細胞數(shù)（相同稀釋倍數(shù)）；

c'——破壁后的細胞數(shù)（相同稀釋倍數(shù)）；

n1——染色后呈無色透明細胞數(shù)；

n2——染色后呈蘭紫色細胞數(shù)。

1.2.6 酵母熱休克處理及電泳樣品制備

根據(jù)現(xiàn)有文獻報道基礎上做了適當?shù)姆治鯷10]，選擇30、37、42、45、48℃和50℃溫度梯度對釀酒酵母菌進行熱激誘導處理30 min。4 000 r/min離心5 min收集菌體，用超純水洗滌三次。按料液比1∶3加入0.5 mol/l Tris-HCl pH值6.8，調(diào)節(jié)高壓均質(zhì)機140 MPa作用3次。加入數(shù)滴巰基乙醇、甘油、10%SDS、溴酚藍。

1.2.7 凝膠電泳的制備

測定蛋白質(zhì)分子量需進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)文獻[11]進行料液配比。分離膠濃度為8%，濃縮膠濃度為5%，染色液為0.25%考馬斯亮藍R-250溶液，脫色液為10%無水乙醇和10%乙酸溶液。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同破壁方法的破壁率（見表1）

表1 凍融法、超聲波法、高壓均質(zhì)機破壁率(%)

釀酒酵母在凍融法、超聲波法和高壓均質(zhì)法等三種方法處理后，測定其破壁率，發(fā)現(xiàn)運用高壓均質(zhì)法破壁效果最好。當進行3次均質(zhì)、原菌液稀釋102時，菌株的破壁率達到94.54%。同時高壓均質(zhì)機在物理方法處理細胞壁中能有效地控制溫度對細胞和熱休克蛋白的活性。本試驗方法簡單，便于后續(xù)試驗的操作。

2.2 菌株熱擊處理后的蛋白變化

5株釀酒酵母在不同溫度下用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒提取熱處理破壁后釀酒酵母菌中分泌的熱休克蛋白(結(jié)果見圖1～圖5)。

圖1 1號菌株不同溫度進行熱激處理

圖2 2號菌株不同溫度進行熱激處理

圖3 3號菌株不同溫度進行熱激處理

圖4 4號菌株不同溫度進行熱激處理

圖5 5號菌株不同溫度進行熱激處理

從圖中可以看出，5株釀酒酵母在熱激處理后新出現(xiàn)了2種清晰的蛋白條帶，或部分原有蛋白表達量增加了，分子量分別位于70 kD和90 kD附近，推測其可能為熱休克70家族和熱休克90家族；另一方面，熱休克應答后，許多蛋白條帶顏色變淺，表面在熱休克過程中，酵母減少了一些正常蛋白的合成。

2.3 熱休克應答內(nèi)參法蛋白圖譜比較

5株釀酒酵母分別提取胞內(nèi)蛋白質(zhì)進行SDSPAGE電泳（見圖1～5），在此基礎上使用IMAGE LAB調(diào)整體積進行分析獲得折線圖（見圖6～10）。

3 討論

3.1 不同破壁效果的差異

對酵母進行高效的破壁處理，是保障后期蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳質(zhì)量的前提條件。不同破壁方法有各自的優(yōu)缺點（如表2）。

圖6 1號菌株不同溫度內(nèi)參法比較

圖7 2號菌株不同溫度進行熱激處理

圖8 3號菌株不同溫度進行熱激處理

圖9 4號菌株不同溫度進行熱激處理

圖10 5號菌株不同溫度進行熱激處理

本研究高壓均質(zhì)處理，酵母的破壁率明顯高于凍融法和超聲波法。究其原因，這是由于高壓均質(zhì)可破壞酵母細胞的結(jié)構(gòu)，消除底物和酵母內(nèi)源酶的空間位阻，從而加速酵母細胞的自溶，有利于蛋白質(zhì)RNA等大分子物質(zhì)的降解[9]。在一定范圍內(nèi)，均值壓力越高對酵母破壁越有利，但綜合設備均值壓力的限制和操作能耗等因素，均質(zhì)壓力并不是越高越好，應當有一個最佳值[12]。本試驗中，在140 MPa壓力下，經(jīng)2～3次循環(huán)，即可獲得良好的破壁率。

3.2 熱應激蛋白與溫度的相關(guān)性

有研究表明，機體在高溫等不良環(huán)境中會自發(fā)產(chǎn)生熱休克應答反應來保護自己[13]。酵母在熱休克應答過程中，能極快地誘導產(chǎn)生一組特殊的蛋白質(zhì)——熱休克蛋白（HSP）[14]，細胞耐熱性的增強同熱激蛋白的累積密切相關(guān)[15]。從圖1～圖5可以看出在30℃下目標蛋白不夠清晰，37℃之后逐漸清晰，42℃后條帶表達量對比值達到最大分泌，到達最高值。之后雖然還存在目標蛋白但表達量不夠,逐漸減少。根據(jù)圖6～圖10知道第3株菌株的耐熱性相對于其他菌株而言更好，它在45、48℃的表現(xiàn)比其他4株更為明顯。

表2 凍融法、超聲波法、高壓均質(zhì)法原理及優(yōu)缺點

酵母菌具有十分復雜的耐熱機制，該機制與細胞內(nèi)多個生理過程的改變有著密切關(guān)聯(lián)，維持細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的過程，包括誘導表達熱激蛋白的過程[16]，重構(gòu)代謝過程等[17-18]。本試驗釀酒酵母熱擊后新出現(xiàn)了2種清晰的蛋白條帶，經(jīng)目前HSP的分類系統(tǒng)[19]比較后應屬于熱休克蛋白70家族和熱休克蛋白90家族。但并不是所有菌株都明顯出現(xiàn)熱休克90家族。

對于未來研發(fā)高抗性酵母益生菌制劑及代替抗生素，成為一種安全的生物制劑。對于動物消化道菌落具有調(diào)節(jié)作用，后期也可加入飼料中，增強其耐受性。

4 結(jié)論

肉鴨消化道酵母菌株的耐熱性存在差異，不同菌株的耐熱性與熱休克蛋白70家族和90家族的表達密切相關(guān)。研究試驗菌株中3號菌株的熱應激耐受性最佳，可以作為后續(xù)肉鴨專用飼用酵母益生菌的備選菌株，為開發(fā)高抗性、專一型的酵母益生菌制劑奠定基礎。