王燕，賴普輝

(陜西國際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，陜西 咸陽712046)

玉米須，又稱龍須，為禾本科玉蜀屬植物玉米的花柱和柱頭［1］，其性平、味甘、無毒，具有利尿、平肝、利膽、抗氧化、增強(qiáng)免疫力、清除自由基等功效［2］。玉米須含有生物堿、黃酮、揮發(fā)油、維生素C、維生素K、甾醇及各種有機(jī)酸等多種活性成分［3～4］，是2010版《中國藥典》中藥一部收錄的品種之一，主要用于高血壓、糖尿病、水腫、腎結(jié)石等疾病的治療。玉米須中富含具備生理功能的活性物質(zhì)黃酮。黃酮類物質(zhì)具有抑菌、止血、抗氧化、保護(hù)心腦血管等作用，已引起人們的廣泛關(guān)注［5］。玉米在中國種植廣泛，玉米須長期以來被當(dāng)作玉米生產(chǎn)中的副產(chǎn)物，僅有少量入藥，其余均被丟棄，造成資源極大浪費(fèi)。從玉米須中提取黃酮類物質(zhì)，對其進(jìn)行開發(fā)研究，具有廣泛的開發(fā)前景［6］。

微波輔助提取法與超聲波及傳統(tǒng)提取方法相比，具有設(shè)備簡單、高效、節(jié)能、污染小等的特點(diǎn)［7］，廣泛應(yīng)用生化、食品、天然產(chǎn)物提取等領(lǐng)域。白建華等以微波輔助提取法對玉米須黃酮進(jìn)行提取，采用正交實驗法進(jìn)行工藝優(yōu)化，最終提取率為1．13%［8］;張艷采用超聲波加酶法提取玉米須黃酮，提取率1．26%［9］;李俠等將超聲波-雙酶法結(jié)合提取玉米須黃酮，提取率為0．86%，比傳統(tǒng)方法提取率高［10］;周鴻立等采用正交實驗法，對微波法和熱回流法提取成熟期玉米須黃酮的工藝進(jìn)行優(yōu)化，提取率分別為 4．55%和 3．17%［11］。目前尚未見到響應(yīng)曲面法優(yōu)化玉米須總黃酮的微波輔助提取工藝的報道。

本研究以中國豐富的成熟期的玉米須資源為實驗材料，采用響應(yīng)曲面法中Box-Behnken Design(BBD)進(jìn)行實驗設(shè)計，對微波輔助法提取玉米須黃酮的工藝進(jìn)行優(yōu)化，為深度開發(fā)這一天然資源提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

玉米須 (成熟期)，產(chǎn)地河南，購自西安藥材市場，洗凈、曬干、粉碎，干燥通風(fēng)處保存。蘆丁，購自中國 (長春)藥品生物制品檢定所。氫氧化鈉、硝酸鋁分析純、亞硝酸鈉、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純。800型離心沉淀器 (上海手術(shù)儀器廠)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52型 (上海青蒲滬西儀器廠)，電子分析天平FA型 (上海恒平科學(xué)儀器有限公司)，循環(huán)水式真空泵SHZ-D(Ⅲ)型 (鞏義市英峪儀器廠)，電子恒溫水浴鍋DZKW-4型 (上海金橋科析儀器廠)，電熱真空干燥箱ZK-82A型(上海試驗儀器廠有限公司)，紫外可見分光光度計724型 (上海精密儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1．2．1 玉米須總黃酮的提取

稱取一定量粉碎的玉米須粉，加入一定濃度乙醇溶液，經(jīng)微波提取后離心，取上層清液備用。

1．2．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密稱取0．155 0 g蘆丁，用70%乙醇溶解后完全轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，定容。分別取對照品溶液0．0 mL、0．5 mL、1．0 mL、1．5 mL、2．0 mL、2．5 mL、3．0 mL于10 mL棕色容量瓶中，隨后用70%乙醇補(bǔ)充至5．0 mL，0．30 mL 4%NaNO2溶液、搖勻、靜置5 min后加入0．30 mL 10%的Al(NO3)3溶液，搖勻、靜置6 min后加入1 mol/L的NaOH溶液4 mL，靜置15 min，以70%乙醇定容至刻度。以70%乙醇為空白，在200～700 nm之間用紫外-可見光進(jìn)行掃描，測定吸光度，以獲取蘆丁的最大吸收波長。在最大吸收波長下，以70%乙醇為空白，以不同濃度照品質(zhì)量濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度值 (A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．2．3 樣品的測定

采用硝酸鋁-亞硝酸鈉-氫氧化鈉法，將精密移取0．5 mL提取液于10 mL量瓶中，以試劑空白作為參比，按照1．2．2方法進(jìn)行測定，計算玉米須總黃酮提取率。

1．2．4 Box-Behnken 實驗設(shè)計

單因素實驗結(jié)果表明，影響玉米須總黃酮提取的主要因素:微波功率、提取時間和液固比，將其分別用A、B和C表示。根據(jù)響應(yīng)曲面優(yōu)化法中的Box-Behnken實驗設(shè)計原理，對因素的高、中、低水平分別以+1、0、-1進(jìn)行編碼 (表1)。

表1 BBD實驗設(shè)計的因素與水平Tab．1 Experimental levels employed for Box-Behnken design

1．2．5 數(shù)據(jù)處理

采用用統(tǒng)計軟件Design Expert 7．1．0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，建立實驗?zāi)Ｐ停⑦M(jìn)行相關(guān)的顯著性檢驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 最大吸收波長的確定

按照1．2．2方法，在200～700 nm間對蘆丁對照品溶液進(jìn)行紫外可見光譜掃描，以波長為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)的蘆丁紫外吸收曲線 (圖1)?？梢源_定的最大吸收波長為510 nm。

圖1 蘆丁紫外吸收曲線Fig．1 Rutin UV absorption spectrum

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在最大吸收波長510 nm條件下，繪制對照品濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線 (圖2)。對圖中的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸得盧丁對照品濃度C(mg/mL)與吸光度值 (A)的方程為 A=0．591C-0．001(R2=0．999 7)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖2 盧丁標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig．2 Standard absorbance curve of Luteolin

2.3 響應(yīng)曲面實驗結(jié)果與分析

2．3．1 響應(yīng)曲面實驗結(jié)果

按照響應(yīng)曲面法的BBD設(shè)計方法，得到17個實驗點(diǎn)的設(shè)計方案 (表2)。其中12個實驗點(diǎn)為析因點(diǎn)，5個為零點(diǎn)。析因點(diǎn)為自變量取值在A、B、C所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，重復(fù)試驗5次，用以估算試驗誤差。

2．3．2 回歸模型方程的建立及其顯著性檢驗

以總黃酮提取率Y(%)為響應(yīng)值，通過Design Expert 7．1．0軟件對表2試驗結(jié)果進(jìn)行擬合分析，獲得多元二次回歸方程為:Y=1．367-0．081 A+0．117B-0．071C-0．041AB+0．141AC-0．120BC-0．382A2-0．433B2-0．409C2(R2=0．978 4)。

由于回歸方程中各項系數(shù)絕對值大小反映了各因素對響應(yīng)值的影響程度，則影響總黃酮提取率的因素大小順序為B＞A＞C。為驗證模型的有效性，進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗 (表3)。

表2 BBD實驗設(shè)計和實驗結(jié)果Tab．2 Box-Behnken design and observed responses

模型的P值小于0．05，表明本研究采用的多元二次模型方程具有高度的顯著性;失擬項P值為0．062 6，失擬不顯著，表明實驗誤差小，方程擬合程度較好，該方程可以反映出真實的實驗過程。相關(guān)系數(shù)反映各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系，分析結(jié)果R2=0．978 4表明模型較好地反映了微波功率、提取時間、液固比等三個因素與黃酮提取率間的關(guān)系，即可以利用該模型分析和預(yù)測不同提取條件下總黃酮的提取率的變化。同時表明，一次項B、二次項A2、B2、C2對黃酮提取率影響極顯著;交互項AC、BC對黃酮提取率影響顯著。

表3 二次回歸模型的方差分析結(jié)果Tab．3 Analysis result of variance(ANOVA)for the fitted quadratic polynomial model

2．3．3 響應(yīng)曲面結(jié)果的優(yōu)化

根據(jù)模型方程繪制響應(yīng)曲面圖和等高線圖，分別考察微波功率、提取時間和液料比等三個因素對黃酮提取率的影響 (圖3～5)。各組圖分別直觀的反映了各因素及交互作用對總黃酮提取率的影響。

圖3 微波功率和提取時間對玉米須總黃酮提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig．3 Response surface and contour plots showing the interactive effect of microwave power and extraction time on the extraction rate of total flavonoids

等高線圖上，微波功率對提取率的影響曲線比較平緩，表明其對提取率的影響相對較小 (圖3);提取時間對提取率的影響比較顯著，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。兩因素對提取率的影響并非直線關(guān)系，并且兩因素的交互作用不顯著，與方差分析結(jié)果一致。響應(yīng)曲面圖開口向下，表明在實驗所選范圍內(nèi)存在極大值?？纱_定的最佳水平范圍:微波功率為120～260 W。

圖4 微波功率和液固比總黃酮提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig．4 Response surface and contour plots showing the interactive effect of microwave power and liquid to sample ratio on the extraction rate of total flavonoids

微波功率和液固比對提取率的影響曲線均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢 (圖4)，表明二者影響都較為顯著，即二者交互作用顯著。在實驗所選范圍內(nèi)存在極大值。因此可確定的最佳水平范圍:提取時間為8-13 min。

等高線上看出，液固比的影響曲線較提取時間的影響曲線較為平緩 (圖5)，表明提取時間對提取率的影響較液固比的影響更為顯著。在實驗范圍內(nèi)存在極值?？纱_定的液固比水平范圍為:11～16 mL/g。

綜合圖3～5表明，因素對提取率的影響大小順序為:B(提取時間) ＞C(液固比) ＞A(微波功率);因素的交互作用對提取率的影響順序為:AC＞BC＞AB，與方差分析結(jié)果完全一致。

圖5 提取時間和液固比對總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖Fig．5 Response surface and contour plots showing the interactive effect of extraction time and liquid to sample ratio on the extraction rate of total flavonoids

2．3．4 最佳工藝條件的確定

對模型方差進(jìn)行求導(dǎo)計算。得到因素的最優(yōu)水平分別為微波功率233．2 W，提取時間10．8 min，液固比14．1 mL/g，在該條件下玉米須中總黃酮的提取率為1．421%?？紤]到實際操作的情況，將微波功率調(diào)整為240 W、提取時間為11 min、液料比14 mL/g，在該條件下平行提取3次，最終得到玉米須總黃酮的實際提取率為1．401%，模型理論預(yù)測值為1．432%，偏差僅2．17%。

3 結(jié)論

本研究基于微波輔助法的提取優(yōu)點(diǎn)，以中國資源豐富的成熟期玉米須為研究對象，對陜產(chǎn)玉米須(成熟期)中總黃酮進(jìn)行了微波輔助法提取，并采用響應(yīng)曲面法進(jìn)行了工藝優(yōu)化，結(jié)合實際提取條件，得到玉米須總黃酮的最優(yōu)提取條件，該工藝下均比文獻(xiàn)報道的提取方法總黃酮提取率高。為進(jìn)一步開發(fā)中國資源豐富的玉米須資源提供了參考。

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