龍麗輝，梁少麗，韓旭亮，劉 靜，曹永孝＊（.西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，西安 70077；.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥理學(xué)系，西安 7006）

六肽對(duì)犬血小板聚集功能的影響

龍麗輝1，梁少麗1，韓旭亮1，劉 靜2，曹永孝2＊（1.西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，西安 710077；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥理學(xué)系，西安 710061）

目的 研究六肽對(duì)犬血小板聚集功能的影響。方法 采集犬股動(dòng)脈血，以枸櫞酸鈉抗凝，用比濁法測犬血小板在不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)時(shí)的聚集率。結(jié)果 1×10－6mol·L－1六肽，抑制由二磷酸腺苷、花生四烯酸和凝血酶誘導(dǎo)的犬血小板聚集的抑制率分別為88.47%±1.15%，97.68%±0.72%和32.02%±3.78%；六肽1×10－8～1×10－5mol·L－1組對(duì)由ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率顯著低于對(duì)照組（P＜0.01或P＜0.05），且各劑量對(duì)之間相應(yīng)的血小板聚集率有顯著差異（P＜0.01或P＜0.05）。六肽抑制犬由花生四烯酸、二磷酸腺苷和凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集的IC50分別為1.29×10－9，7.24×10－8和2.88×10－6mol·L－1；對(duì)于依替巴肽，同等條件下測得其IC50分別為6.76×10－10，5.74×10－8和1.62×10－6mol·L－1。結(jié)論 六肽在體外可以抑制犬血小板聚集，其作用效果類似于依替巴肽。

六肽；血小板聚集；二磷酸腺苷

血小板具有諸多功能，能夠參與止血和血栓形成，血小板功能亢進(jìn)是血栓性疾病的直接危險(xiǎn)因素，因而血小板功能的研究在血栓形成的研究中日益處于重要地位。有研究證實(shí)，六肽血栓靶向微泡對(duì)犬股靜脈血栓超聲回聲強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，比基線和非靶向微泡回聲強(qiáng)度明顯增強(qiáng)［1］；六肽血栓靶向微泡聯(lián)合低頻超聲，動(dòng)脈內(nèi)給藥或靜脈給藥，對(duì)缺血性腦卒中1h兔大腦中動(dòng)脈腦血栓有顯著的溶栓效果［2］。本文通過研究六肽對(duì)體外犬血小板聚集功能的影響，旨在探索六肽的抗血栓作用是否與其對(duì)血小板功能的影響有關(guān)，是否可以通過抑制血小板的聚集而抗血栓形成。

1 儀器與材料

1.1 儀器 五分類全自動(dòng)血液分析儀（Sysmex SE－9000型，日本）；四通道血小板聚集儀（LBY－NJ4型，北京普利生儀器有限公司）；電子分析天平（AB 135－S型，瑞士梅特勒托利多公司）；臺(tái)式離心機(jī)（TL－4型，湖南儀器儀表總廠）；旋渦混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；超聲波清洗機(jī)（CQ－120型，上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠）。

1.2 試藥 六肽（代號(hào)P1Z4A5，北京生物制品研究所，批號(hào)090106）；氯吡格雷（濟(jì)南樂康信藥業(yè)有限公司，批號(hào)080301）；依替巴肽（蘇州肽生產(chǎn)有限公司，批號(hào)2008010301）；雙嘧達(dá)莫注射液（山西亞保藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)070801）；腎上腺素注射液（天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)070412）；凝血酶（長春國奧藥業(yè)有限公司，批號(hào)2081101）；阿司匹林（Sigma公司，貨號(hào)A 2093－100G）；花生四烯酸（Sigma公司，貨號(hào)A 9673－10MG）；ADP Na2（Sigma公司，貨號(hào)為A2754－1G）；水為實(shí)驗(yàn)室雙蒸水。

1.3 動(dòng)物 健康家犬6只，雌雄兼用，體質(zhì)量15～30kg，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：陜醫(yī)動(dòng)證字第082004號(hào)，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，喂顆粒飼料。

2 方法

2.1 藥物溶液配制 取適量六肽置于EP管中，加反應(yīng)量10g·L－1碳酸鈉水溶液，搖勻，加0.009 g·L－1注射用生理鹽水，超聲15min，備用，臨用前配成6×10－8～6×10－4mol·L－1的溶液。取適量依替巴肽，加0.009g·L－1注射用生理鹽水，超聲15 min，備用，臨用前配成6×10－5mol·L－1的溶液。取阿司匹林適量，臨用前，溶于碳酸鈉（100mmol·L－1）水溶液中，以鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.0［3］。二磷酸腺苷用生理鹽水配制成3 000μmol·L－1的溶液，置于－20℃冰箱備用，臨用前，以生理鹽水稀釋至所需濃度；花生四烯酸用無水乙醇配成0.1g·L－1溶液，臨用前，再用碳酸鈉溶液（0.1g·L－1）稀釋至所需濃度［4］。

2.2 血小板聚集 犬用0.03g·L－1戊巴比妥鈉溶液（40mg·kg－1）腹腔注射麻醉，采股動(dòng)脈血，以枸櫞酸鈉（0.038g·L－1）∶全血為1∶9抗凝。血小板的制備：上下顛倒裝有抗凝血的試管數(shù)次，以1 000 r·min－1離心10min，得到富血小板血漿（PRP）；吸取上清液，以3 000r·min－1離心10min，得到貧血小板血漿（PPP），若無溶血現(xiàn)象的血漿可用。以PPP調(diào)節(jié)PRP管血小板數(shù)，最終使PRP達(dá)到約250 nL－1。以上操作在室溫下進(jìn)行。

血小板聚集實(shí)驗(yàn)：依文獻(xiàn)描述［5］，取含300μL血小板數(shù)250nL－1的血漿于樣品方杯中，置于四通道血小板聚集儀的預(yù)熱孔中，分別加生理鹽水、六肽溶液（終濃度1×10－5～1×10－9mol·L－1）、依替巴肽溶液（終濃度1×10－6mol·L－1）、氯吡格雷溶液（終濃度3×10－5mol·L－1）、雙嘧達(dá)莫溶液（終濃度2×10－6mol·L－1）和阿司匹林（終濃度2.8×10－4mol·L－1），于37℃培育20min后，以PRP調(diào)節(jié)各測試孔透光率為0%，以PPP調(diào)節(jié)各測試孔透光率為100%。各受試方杯分別加入ADP（終濃度50μmol·L－1）與腎上腺素（終濃度為2μmol·L－1）、花生四烯酸（終濃度1.0 mmol·L－1）或凝血酶（終濃度0.4U·mL－1）誘導(dǎo)血小板活化，同時(shí)加入磁子攪拌，計(jì)時(shí)，記錄各樣本5 min內(nèi)血小板聚集曲線。按下式計(jì)算血小板聚集抑制率。血小板聚集抑制率（%）＝ （對(duì)照組血小板聚集率－受試組血小板聚集率）／對(duì)照組血小板聚集率×100%。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以x±s表示。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用非配對(duì)t檢驗(yàn)法檢驗(yàn)組間和組內(nèi)差異，以P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。作圖使用Graph Pad Prism 5.0軟件。

3 結(jié)果

3.1 由ADP誘導(dǎo)的犬血小板聚集 采集犬抗凝血，進(jìn)行六肽及4種陽性對(duì)照藥對(duì)其血小板聚集率的測定。由表1可知，1×10－8mol·L－1～1×10－5mol·L－1六肽，使用ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率分別為43.90%±3.72%，31.16%±3.16%，6.28%± 1.15%和3.30%±1.27%，顯著低于對(duì)照組54.49% ±1.10%（P＜0.01或P＜0.05），且六肽不同劑量組之間的血小板聚集率有顯著差異（P＜0.01或P＜0.05）。ADP受體拮抗劑氯吡格雷對(duì)血小板聚集抑制率為89.19%±0.56%。

表1 六肽對(duì)50μmol·L－1ADP誘導(dǎo)的犬血小板聚集的作用Tab.1 Effect of hexapeptide on dog platelet aggregation induced by 50μmol·L－1ADP （±s，n＝6）

表1 六肽對(duì)50μmol·L－1ADP誘導(dǎo)的犬血小板聚集的作用Tab.1 Effect of hexapeptide on dog platelet aggregation induced by 50μmol·L－1ADP （±s，n＝6）

注：與對(duì)照組比＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 濃度／mol·L－1 聚集率／% 聚集抑制率／%對(duì)照組 －54.49±1.10 0六肽 1×10－5 3.30±1.27＊＊93.94±1.27＊＊六肽 1×10－6 6.28±1.15＊＊88.47±1.15＊＊六肽 1×10－7 31.16±3.16＊＊42.82±3.16＊＊六肽 1×10－8 43.90±3.72＊19.43±3.72＊六肽 1×10－9 47.02±5.63 13.71±5.63依替巴肽 1×10－6 4.28±1.61＊＊92.14±1.61＊＊氯吡格雷 3×10－5 5.89±0.56＊＊89.19±0.56＊＊雙嘧達(dá)莫 2×10－5 47.42±4.98 12.97±4.98阿司匹林 2.8×10－5 31.87±2.43＊＊41.51±2.43＊＊

3.2 由AA誘導(dǎo)的犬血小板聚集 由表2可知，由花生四烯酸誘導(dǎo)的對(duì)照組犬血小板聚集率為46.57% ±3.83%，六肽各劑量組及4種陽性對(duì)照藥對(duì)由AA誘導(dǎo)的血小板聚集率均顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）。AA通路拮抗劑阿司匹林的血小板聚集抑制率為98.78%±0.18%。結(jié)果表明，六肽可以顯著抑制由AA誘導(dǎo)的犬血小板的聚集。

表2 六肽對(duì)1.0mmol·L－1AA誘導(dǎo)的犬血小板聚集的作用Tab.2 Effect of hexapeptide on dog platelet aggregation induced by 1.0mmol·L－1AA ±s，n＝6）

表2 六肽對(duì)1.0mmol·L－1AA誘導(dǎo)的犬血小板聚集的作用Tab.2 Effect of hexapeptide on dog platelet aggregation induced by 1.0mmol·L－1AA ±s，n＝6）

注：與對(duì)照組比＊＊P＜0.01。

組別 濃度／mol·L－1 聚集率／% 聚集抑制率／%對(duì)照組 － 46.57±3.82 0六肽 1×10－5 0.23±0.52＊＊99.51±0.52＊＊六肽 1×10－6 1.08±0.72＊＊97.68±0.72＊＊六肽 1×10－7 1.37±0.62＊＊97.06±0.62＊＊六肽 1×10－8 8.51±0.71＊＊81.72±0.71＊＊六肽 1×10－9 26.46±3.57＊＊43.18±3.57＊＊依替巴肽 1×10－6 0.45±0.24＊＊99.03±0.24＊＊氯吡格雷 3×10－5 9.97±0.96＊＊78.59±0.96＊＊雙嘧達(dá)莫 2×10－5 11.66±2.40＊＊74.96±2.40＊＊阿司匹林2.8×10－5 0.57±0.18＊＊98.78±0.18＊＊

3.3 由凝血酶誘導(dǎo)的犬血小板聚集 由表3可知，由凝血酶誘導(dǎo)的對(duì)照組犬血小板聚集率為54.40% ±3.07%，1×10－7mol·L－1～1×10－5mol·L－1六肽對(duì)凝血酶誘導(dǎo)的犬血小板聚集率，與對(duì)照組相比，顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。

表3 六肽對(duì)0.4 U·mL－1凝血酶誘導(dǎo)的犬血小板聚集的作用Tab.3 Effect of hexapeptide on dog platelet aggregation induced by 0.4U·mL－1thrombin ±s，n＝6）

表3 六肽對(duì)0.4 U·mL－1凝血酶誘導(dǎo)的犬血小板聚集的作用Tab.3 Effect of hexapeptide on dog platelet aggregation induced by 0.4U·mL－1thrombin ±s，n＝6）

注：與對(duì)照組比＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 濃度／mol·L－1 聚集率／% 聚集抑制率／%對(duì)照組 － 54.40±3.07 0六肽 1×10－5 19.38±1.73＊＊ 64.38±1.73＊＊六肽 1×10－6 36.98±3.78＊ 32.02±3.78＊六肽 1×10－7 38.57±4.69＊ 29.10±4.69＊六肽 1×10－8 38.94±5.73 28.42±5.73六肽 1×10－9 47.60±4.25 12.50±4.25依替巴肽 1×10－6 34.59±1.86＊＊ 36.42±1.86＊＊氯吡格雷 3×10－5 53.47±2.76 1.71±2.76雙嘧達(dá)莫 2×10－5 46.85±5.00 13.88±5.00阿司匹林 2.8×10－512.94±2.95＊＊ 76.21±2.95＊＊

3.4 不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的犬血小板聚集的IC50由圖1計(jì)算，可得六肽分別由AA、ADP和Thrombin誘導(dǎo)的犬血小板的IC50分別為1.29×10－9，7.24× 10－8和2.88×10－6mol·L－1，同等條件下測得依替巴肽對(duì)由AA、ADP和Thrombin誘導(dǎo)的犬血小板的IC50分別為6.76×10－10，5.74×10－8和1.62×10－6mol·L－1。結(jié)果提示，六肽對(duì)ADP、AA和凝血酶誘導(dǎo)的犬血小板聚集有抑制作用，且與依替巴肽對(duì)ADP和凝血酶誘導(dǎo)血小板聚集抑制效果相比，無數(shù)量級(jí)的差異。

圖1 六肽抑制50μmol·L－1ADP，1.0mmol·L－1AA和0.4 U·mL－1凝血酶誘導(dǎo)的犬血小板聚集的濃度－效應(yīng)曲線注：數(shù)據(jù)表示為x±s，n＝6。Fig.1 The concentration－response curves of hexapeptide inhibiting platelet aggregation induced by 50μmol·L－1ADP，1.0 mmol·L－1AA and 0.4U·mL－1thrombin in dogNote：Data were±s，n＝6

4 討論

血小板被某種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)激活后，可釋放包括加入的誘導(dǎo)劑之外的內(nèi)源性誘導(dǎo)劑，加劇血小板聚集，因此，即使加入某一種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)血小板聚集，不僅作用于該通路的拮抗劑起效，作用于其他路徑的拮抗劑也會(huì)由于血小板的釋放作用而起到相應(yīng)的抑制作用，即于相應(yīng)通路抑制血小板聚集。本實(shí)驗(yàn)中所選用的血小板聚集誘導(dǎo)劑有ADP，其對(duì)應(yīng)的拮抗劑選用了氯吡格雷［6－8］；當(dāng)誘導(dǎo)劑為AA時(shí)，其對(duì)應(yīng)通路的拮抗劑選用了阿司匹林［9－10］；當(dāng)誘導(dǎo)劑為凝血酶時(shí)，其對(duì)應(yīng)通路的拮抗劑選用了雙嘧達(dá)莫［11］；當(dāng)我們用AA作為誘導(dǎo)劑時(shí)，不僅阿司匹林具有顯著的抑制血小板聚集作用，而且雙嘧達(dá)莫和氯吡格雷都有顯著抗聚集作用。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，我們所采用的陽性對(duì)照藥物依替巴肽（eptifibatide）［1215］，是化學(xué)合成的對(duì)GPⅡb／Ⅲa受體有特異識(shí)別作用的、含有KGD結(jié)構(gòu)（賴氨酸－甘氨酸－天門冬氨酸，Lys－Glu－Asn）的環(huán)狀七肽，該序列結(jié)構(gòu)對(duì)糖蛋白受體有更高的親和力和選擇性。誘導(dǎo)劑雖有不同，但是能夠作用于血小板聚集最終通路的GPⅡb／Ⅲa受體拮抗劑依替巴肽，產(chǎn)生了顯著的抗血小板聚集作用。

六肽［16］，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為H－Pro－Ser－Nva－Gly－Asp－Trp－OH，是在標(biāo)準(zhǔn)化氨基酸功能保護(hù)下，應(yīng)用固相肽合成方法制備的，并用高效液相法、核磁共振法及質(zhì)譜法進(jìn)行定性定量分析，確定質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%的化合物。我們對(duì)其抗血栓形成機(jī)制進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，該藥分別在上述幾種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的血小板聚集過程中，均產(chǎn)生了顯著的抑制作用，且與依替巴肽有相似的抑制曲線及基本一致的IC50。Scarborough等報(bào)道［17］，阿西單抗、替洛非班和依替巴肽的對(duì)犬血小板聚集的IC50分別為5，15和120nmol·L－1，替洛非班的IC50的數(shù)量級(jí)與我們所研究得到的六肽（7.24×10－8mol·L－1）及依替巴肽（5.74×10－8mol·L－1）的IC50數(shù)量級(jí)相同（均為ADP誘導(dǎo)）。由此我們可以得到的結(jié)論是：六肽和依替巴肽對(duì)由ADP誘導(dǎo)的犬血小板聚集的抑制作用基本相同。我們認(rèn)為，六肽的抗血小板聚集的藥效類似于依替巴肽，但其作用機(jī)制是否也類似于依替巴肽［18－19］，尚需要進(jìn)一步研究。

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Influence of hexapeptide on platelet aggregation function in dog

LONG Lihui1，LIANG Shaoli1，HAN Xuliang1，LIU Jing2，CAO Yongxiao2＊（1.Department of Pharmacy，Affiliated Hospital of Xi′an Medical College，Xi′an 710077，China；2.Department of Pharmacology，Health Science Center，Xi′an Jiaotong University Xi′an 710061，China）

Objective This study was aimed to investigate the aggregation effect of hexapeptide on dog platelets.Methods Arteria cruralis blood of dog was sampled and anticoagulated with sodium citrate.The platelet aggregation rates induced by different inducers were determined with the method of turbidimetric test.Results The inhibition rates of dog platelet aggregation of 1×10－6mol·L－1hexapeptide induced by ADP，arachidonic acid and thrombin，were 88.47%±1.15%，97.68%±0.72%and 32.02%± 3.78%，respectively.The aggregation rates of dog platelet aggregation of 1×10－8to 1×10－5mol·L－1hexapeptide induced by ADP were significantly lower than that of control group（P＜0.01or P＜0.05），and the corresponding aggregation rates of each dosage groups had significant difference（P＜0.01or P＜0.05）.The anti－platelet aggregation IC50of hexapeptide induced by arachidonic acid，ADP and thrombin，were 1.29×10－9，7.24×10－8and 2.88×10－6mol·L－1，respectively.For eptifibatide，the anti－platelet aggregation IC50were 6.76×10－10，5.74×10－8and 1.62×10－6mol·L－1，respectively.Conclusion Hexapeptide can restrain dog platelet aggregation in vitro，and the effect is similar to eptifibatide.

hexapeptide；platelet aggregation；ADP

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.02.017

R965

A

1004－2407（2015）02－0158－04

2014－07－15）

陜西省科技廳社發(fā)攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：2012K14－04－01）；西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院項(xiàng)目（編號(hào)：XYFY11－02）

龍麗輝，女，副主任藥師

＊通信作者：曹永孝，男，教授，博士研究生導(dǎo)師