衛(wèi)向鋒，牛春玲，袁倩倩，竇建衛(wèi)，任翠翠＊（.西安中醫(yī)腦病醫(yī)院，西安 7003；.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 7006）

益氣活血片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

衛(wèi)向鋒1，牛春玲1，袁倩倩2，竇建衛(wèi)2，任翠翠2＊（1.西安中醫(yī)腦病醫(yī)院，西安 710032；2.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061）

目的 建立益氣活血片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用TLC法對(duì)制劑中的黃芪、當(dāng)歸、赤芍、川芎進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜－蒸發(fā)光檢測(cè)器法對(duì)黃芪甲苷進(jìn)行了含量測(cè)定。結(jié)果 黃芪、當(dāng)歸、赤芍、川芎進(jìn)行薄層鑒別具有較好的專屬性；有效成分黃芪甲苷在0.538～26.9μg（r＝0.999 9）范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，平均回收率為98.9%，RSD為1.8%（n＝6）。結(jié)論 所建立的標(biāo)準(zhǔn)可用于該制劑的質(zhì)量控制。

益氣活血片；TLC；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；HPLC

益氣活血片是西安中醫(yī)腦病醫(yī)院長(zhǎng)期應(yīng)用的醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，主要由黃芪、當(dāng)歸、赤芍、川芎、桃仁等組成，具有補(bǔ)氣、活血、通絡(luò)的功效，臨床上用于治療中風(fēng)后遺癥、半身不遂、偏身麻木、口眼歪斜、語(yǔ)言蹇澀、口角流涎等臨床癥狀。為有效控制益氣活血片的質(zhì)量，本文制定了該復(fù)方制劑中黃芪、當(dāng)歸、赤芍、川芎的TLC（薄層色譜）鑒別方法及有效成分黃芪甲苷的高效液相色譜－蒸發(fā)光檢測(cè)（HPLC－ELSD）的含量測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（日本島津LC－20A型）；PL－ELSD2100型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；AB135－S0.01mg分析天平（梅特勒－托利多有限公司）。

1.2 試藥 黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)110781－200613）；芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)110736－201136）；阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)110773－201012）；當(dāng)歸對(duì)照藥材（批號(hào)120927－200512）；川芎對(duì)照藥材（批號(hào)120918－201110），由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。益氣活血片樣品（0.3g／片；批號(hào)20130613，20130619，20130625）。

2 薄層色譜鑒別

2.1 黃芪的薄層鑒別 取益氣活血片10片，先用乙醇溶液擦拭外表面除去糖衣，研缽研細(xì)；藥片粉末用20mL甲醇加熱回流1h，濾過(guò)，將濾液蒸干。殘?jiān)铀?0mL使溶解，用水飽和過(guò)的正丁醇萃取3次，正丁醇體積分別為20，20和10mL，合并正丁醇萃取液；另取40mL 10g·L－1的氫氧化鈉溶液洗滌2次，每次20mL；再用正丁醇飽和的水洗至中性，棄去洗液，蒸干正丁醇液，用1mL的甲醇溶解殘?jiān)?，作為供試品溶液?］。另按處方比例取不含黃芪的陰性對(duì)照藥材，同法制成陰性對(duì)照溶液。取黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)110781－200613）5mg，加5mL甲醇，溶解，制成對(duì)照品溶液。照《中國(guó)藥典》（Ch.P 2010）薄層色譜法（附錄VI B）實(shí)驗(yàn)，用毛細(xì)管吸取上述3種溶液各5μL點(diǎn)于同一薄層板（硅膠G）上，以體積比為13∶7∶2的三氯甲烷－甲醇－水［2］的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴100mL·L－1硫酸乙醇溶液，在105℃加熱2min至斑點(diǎn)顯色清晰。3批樣品在日光與紫外燈365nm下，均具有黃芪甲苷的特征斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.2 當(dāng)歸和川芎的薄層鑒別 取益氣活血片10片，先用乙醇溶液擦拭外表面除去糖衣，研缽研細(xì)；加50mL 10g·L－1碳酸氫鈉溶液，超聲處理10min，離心后取上清液，用稀鹽酸調(diào)pH值至2～3，用40mL乙醚分2次提取，每次20mL；提取完成后合并乙醚液，揮干乙醚液，用1mL的甲醇溶解殘?jiān)?，作為供試品溶液。按處方比例取不含?dāng)歸和川芎的陰性對(duì)照藥材，同法制成雙陰性對(duì)照溶液［3］。稱取當(dāng)歸和川芎對(duì)照藥材各3g，分別按照供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液。再取阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)110773－201012）5mg，加5mL甲醇，溶解制成對(duì)照品溶液。照《中國(guó)藥典》（Ch.P 2010）薄層色譜法（附錄VI B）實(shí)驗(yàn)，用毛細(xì)管吸取上述5種溶液各9μL，點(diǎn)于同一薄層板（硅膠G）上，用體積比為4∶1∶1∶0.1的環(huán)己烷－二氯甲烷－乙酸乙酯－甲酸為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。3批樣品在紫外燈365nm下，均具有阿魏酸、當(dāng)歸對(duì)照藥材及川芎對(duì)照藥材的特征斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.3 赤芍的薄層鑒別 取益氣活血片10片，先用乙醇溶液擦拭外表面除去糖衣，研缽研細(xì)；藥片粉末用20mL乙醇［4］超聲處理10min使溶解，濾過(guò)，濾液揮干。用1mL乙醇溶解殘?jiān)鳛楣┰嚻啡芤?。另按處方比例，取不含赤芍的陰性?duì)照藥材，同法制成陰性對(duì)照溶液。再取芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)110736－201136）10mg，加5mL乙醇，溶解制成對(duì)照品溶液。照《中國(guó)藥典》（Ch.P 2010）薄層色譜法（附錄VI B）實(shí)驗(yàn)，用毛細(xì)管吸取上述3種溶液各10μL，點(diǎn)于同一薄層板（硅膠G）上，以體積比為40∶5∶10∶0.2的三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－甲酸為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴20g·L－1香草醛硫酸溶液，在105℃加熱2min至斑點(diǎn)顯色清晰［5］。3批樣品在日光下，均具有芍藥苷的特征斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。

3 含量測(cè)定

3.1 色譜條件 色譜柱Diamosil C18（250mm× 4.6mm，5μm）；乙腈－水（68∶32）為流動(dòng)相；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器漂移管溫度為75℃；載氣流速為2.0L·min－1；柱溫為40℃。按黃芪甲苷峰計(jì)算，理論板數(shù)應(yīng)不低于4 000。

3.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)110781－200613）5mg，加10mL甲醇溶解，即得對(duì)照品溶液。

3.3 供試品溶液的制備 取益氣活血片30片，先用乙醇溶液擦拭外表面除去糖衣，研缽研細(xì)；稱取藥片粉末適量（約6g），精密稱定。置于索氏提取器內(nèi)，加40mL的甲醇冷浸過(guò)夜，再加甲醇至合適量加熱回流4h，提取液回收甲醇，蒸干溶劑，殘?jiān)尤羲?0mL，略微加熱使溶解；再用水飽和過(guò)的正丁醇提取5次，體積分別為20，20，20，20和15mL，最后合并正丁醇提取液；再用氨試液洗滌4次，體積分別為25，20，20和20mL［6－7］，棄去氨洗液，再蒸干正丁醇液，殘?jiān)?0～20mL熱水溶解，放冷至室溫。通過(guò)D101型（內(nèi)徑1.5cm，長(zhǎng)12cm）大孔吸附樹(shù)脂柱，用50mL蒸餾水洗脫，棄去水液；再用30mL體積分?jǐn)?shù)40%的乙醇洗脫，棄去乙醇洗脫液；繼用70mL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇洗脫，洗脫液收集于蒸發(fā)皿內(nèi)。水浴揮干洗脫液，殘?jiān)眠m量甲醇溶解后轉(zhuǎn)移到5mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度；搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

3.4 陰性對(duì)照品溶液的制備 取按處方除去黃芪的陰性樣品適量，按照3.3項(xiàng)下的制備方法制成陰性樣品溶液。

3.5 干擾性實(shí)驗(yàn) 精密吸取益氣活血片的對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各20μL進(jìn)樣，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果陰性樣品在黃芩甲苷位置上未檢出色譜峰，表明處方中其他成分對(duì)黃芪甲苷的測(cè)定不會(huì)產(chǎn)生干擾，該方法具有專屬性。

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照品；1.黃芪甲苷Fig.1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.sample；C.negative sample；1.astragaloside A

3.6 線性關(guān)系考察 精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)110781－200613），加甲醇制成質(zhì)量濃度為1.36 mg·mL－1的溶液，作為黃芪甲苷儲(chǔ)備溶液。精密量取儲(chǔ)備溶液適量，加甲醇稀釋制成黃芪甲苷質(zhì)量濃度分別為0.026 9，0.053 8，0.107 6，0.161 4，0.215 2，0.269 0，0.322 8，0.376 6，0.430 4，0.484 2，0.538 0，0.807 0，1.076 0和1.345 0mg·mL－1的溶液，將以上溶液分別進(jìn)樣20μL，測(cè)定峰面積。以峰面積（Y）對(duì)進(jìn)樣量（X）進(jìn)行線性回歸，得黃芩甲苷的回歸方程：Y＝1.417 8X＋4.749 8，相關(guān)系數(shù)r＝0.999 9。表明黃芪甲苷在0.538～26.9μg之間有良好的線性關(guān)系。

3.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取供試品溶液（批號(hào)20130613）10μL，分別于0，1，2，4，6和8h進(jìn)樣，測(cè)定黃芩甲苷的峰面積。結(jié)果對(duì)照品溶液的RSD為0.89%（n＝6），供試品溶液的RSD為1.33%（n＝6）。表明對(duì)照品溶液和供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定性良好。3.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取益氣活血片（批號(hào)為20130613）的樣品，共6份，按照3.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，分別精密取供試品溶液20μL及對(duì)照品溶液10和20μL進(jìn)樣，測(cè)定，按外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算樣品中黃芪甲苷的含量。結(jié)果，有效成分黃芪甲苷的平均含量為0.21mg·g－1，RSD為1.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取益氣活血片（批號(hào)為20130613）樣品數(shù)片，除去糖衣，研細(xì)，取6份，精密稱定，分別加入黃芪甲苷對(duì)照品溶液適量，攪拌均勻，氮?dú)獯蹈?，?.3項(xiàng)下制成供試品溶液。按上述色譜條件及測(cè)定方法進(jìn)行加樣回收率的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 黃芪甲苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Result of recovery of astragaloside A （n＝6）

3.10 樣品的含量測(cè)定 取3批（批號(hào)20130613，20130619，20130625）不同批次的益氣活血片樣品，采用上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果3批樣品中黃芪甲苷的平均含量為0.20mg·g－1。

4 討論

對(duì)制劑中當(dāng)歸和川芎薄層鑒別時(shí)，由于當(dāng)歸和川芎都含有相同成分阿魏酸，在多種展開(kāi)系統(tǒng)下，對(duì)照藥材色譜在相同位置均顯示相同斑點(diǎn)。因此，為了避免當(dāng)歸和川芎陰性樣品的干擾，當(dāng)歸和川芎的薄層鑒別需增加雙陰性對(duì)照，即用同時(shí)除去當(dāng)歸和川芎的藥材做陰性對(duì)照，結(jié)果薄層效果良好。此外，益氣活血片中的黃芪、赤芍的薄層鑒別結(jié)果斑點(diǎn)集中，顯色清晰。本實(shí)驗(yàn)建立了益氣活血片中有效成分黃芪甲苷的含量測(cè)定方法，并對(duì)方法學(xué)考察驗(yàn)證。結(jié)果表明，HPLC－ELSD測(cè)定黃芪甲苷方法簡(jiǎn)單、快捷、重復(fù)性好，可作為益氣活血片質(zhì)量控制的依據(jù)。

［1］ 李芳，王靜怡，林海，等.養(yǎng)心開(kāi)郁片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.西北藥學(xué)雜志，2013，28（5）：469－471.

［2］ 張鳳瑞，周賢，劉炎，等.當(dāng)歸補(bǔ)血湯中黃芪的鑒別及黃芪甲苷的含量測(cè)定［J］.吉林中醫(yī)藥，2013，33（3）：289－291.

［3］ 楊靜.清心牛黃片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究［J］.中國(guó)藥師，2013，16（11）：1656－1659.

［4］ 徐曉弘，熊鑫.薄層色譜法鑒別活血通脈片研究［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，8（5）：38－40.

［5］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典2010年版［S］.一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：283.

［6］ 聶穎蘭，范斌，郭娜，等.HPLC－ELSD法測(cè)定健脾益腎膠囊中黃芪甲苷的含量［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（17）：130－132.

［7］ 李文韜，史國(guó)兵，孫學(xué)惠，等.復(fù)方參芪五味咀嚼片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（11）：6389－6391.

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Study on quality standard of Yiqihuoxue Tablets

WEI Xiangfeng1，NIU Chunling1，YUAN Qianqian2，DOU Jianwei2，REN Cuicui2＊（1.Xi′an TCM Brain Disease Hospital，Xi′an 710032，China；2.School of Pharmacy，Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710061，China）

Objective To establish the quality standard for Yiqihuoxue Tablets.Methods Astragali Radix，Angelicae sinensis Radix，Paeoniae Radix Rubra and Chuanxiong Rhizomain the prescription were identified by TLC.HPLC－ELSD was adopted for the quantative analysis of astragaloside A which is an effective component of the formula.Results The TLC of Astragalus Radix，Angelicae sinensis Radix，Paeoniae Radix Rubra and Chuanxiong Rhizoma showed good specificity.Astragaloside A showed good linearity over the range of 0.538－26.9μg（r＝0.999 9）and the average recovery was 98.9%，RSD＝1.8%（n＝6）.Conclusion The method can be used for the preparation quality control.

Yiqihuoxue Tablets；TLC；quality standard；HPLC

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.02.008

R917

A

1004－2407（2015）02－0131－03

2014－07－01）

2013年陜西省中醫(yī)藥管理局科研項(xiàng)目（編號(hào)：LC008）

衛(wèi)向鋒，男，中藥士

＊通信作者：任翠翠，女，在讀碩士研究生