黃 瓊，劉 玲，艾爾肯·依不拉音★（.新疆醫(yī)科大學(xué)中心實驗室，烏魯木齊 8300；2.新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司，烏魯木齊 8300）

·中藥及天然藥物·

新疆葡萄樹傷流液皂苷的含量測定

黃 瓊1，2，劉 玲1，艾爾肯·依不拉音1★（1.新疆醫(yī)科大學(xué)中心實驗室，烏魯木齊 830011；2.新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司，烏魯木齊 830011）

目的 對新疆葡萄樹傷流液皂苷含量進行測定。方法 采用化學(xué)法和TLC法對新疆葡萄樹傷流液中皂苷進行定性鑒別，采用香草醛－冰醋酸法測定新疆葡萄樹傷流液的皂苷含量。結(jié)果 新疆葡萄樹傷流液含有一定的皂苷，不同品種、不同產(chǎn)地葡萄樹傷流液的皂苷含量不同，其中吐魯番卡西克葡萄樹傷流液中皂苷含量最高（106.00μg·mL－1），和田市紅葡萄樹傷流液中皂苷含量最低（6.50μg·mL－1）。結(jié)論 新疆葡萄樹傷流液因產(chǎn)地和品種的不同，其皂苷含量也不同。

新疆葡萄樹傷流液；皂苷；TLC；香草醛－冰醋酸法

每年的4月上旬至中旬，干燥無雨，氣溫相對較高，葡萄屬（Vitis L.）葡萄（Vias vinifera L.）植株從其傷口處會自動流出無色透明的液體即葡萄樹傷流液［1］。本課題組在前期的工作中，采用自建的羥自由基（·OH）體系檢測并研究比較新疆不同產(chǎn)地葡萄樹傷流液的體外抗氧化活性，結(jié)果表明，新疆葡萄樹傷流液具有較強的抗氧化活性，特別是對·OH的清除能力較強，且葡萄樹傷流液對·OH清除率具有較強的熱穩(wěn)定性，甚至可耐95℃的高溫［2］。相關(guān)研究［3－6］表明，絞股藍皂苷、人參皂苷、文冠果果殼皂苷、油茶皂苷等植物皂苷均有比較強的抗氧化作用，其他植物或海洋生物中的皂苷也有一定的生物活性，而皂苷是否是新疆葡萄樹傷流液的抗氧化活性物質(zhì)需進一步分析。因此，本實驗采用化學(xué)法和薄層色譜法（TLC）對新疆葡萄樹傷流液是否含有皂苷進行鑒別，采用香草醛－冰醋酸法對葡萄樹傷流液的皂苷含量進行了測定，為將其開發(fā)成天然抗氧化劑提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV－2550型紫外可見分光光度計（日本Shimadu公司）；Linomat 5型薄層色譜點樣儀、Re－prostar 3型薄層色譜攝像儀、Heater 3型薄層色譜加熱儀（瑞士CAMAG公司）；N－1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、CA－1111型冷卻水循環(huán)裝置、SB－1000型水浴鍋（上海愛朗儀器有限公司）；SHB－Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司）；AEL－160型電子天平（日本Shimadu公司）；HWS26型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 材料 葡萄樹傷流液于2013年4月初分別在新疆吐魯番鄯善縣、和田市、和田縣、喀什市和阿圖什市采集，冷凍保存，原植物即葡萄品種由新疆醫(yī)科大學(xué)帕麗達·阿不力孜教授鑒定。

齊墩果酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110709－201206）；香草醛（上海阿拉丁試劑有限公司）；茴香醛（天津市光復(fù)精細化工研究所）；醋酐（天津市辰光化工有限公司）；氯仿（西安化學(xué)試劑廠）；乙酸乙酯（天津市富宇精細化工有限公司）；冰乙酸（天津市化學(xué)試劑研究所）；濃硫酸（西安化學(xué)試劑廠）；高氯酸（天津市鑫源化工有限公司）；甲醇（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司）；無水乙醇（天津市永晟精細化工有限公司）；實驗用水為二次重蒸水。

硅膠高效G板（青島海洋化工廠分廠，10cm× 20cm，批號20120812）。

2 實驗方法

2.1 樣品溶液的制備 新疆吐魯番鄯善縣、和田市、和田縣、喀什市和阿圖什市葡萄樹傷流液，經(jīng)50℃減壓濃縮20倍左右，進行皂苷化學(xué)、TLC和含量測定實驗。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取齊墩果酸對照品10.10mg，用無水乙醇定容于10mL棕色量瓶中，此為儲備液。精密吸取儲備液1mL，用無水乙醇定容于10mL棕色量瓶中，即得101μg·mL－1的齊墩果酸對照品溶液。

2.3 皂苷化學(xué)實驗

2.3.1 泡沫實驗 在試管中加入不同品種、不同產(chǎn)地葡萄樹傷流液2mL，強烈振搖1min后放置，觀察泡沫持續(xù)時間。

2.3.2 醋酐－濃硫酸實驗 取不同品種、不同產(chǎn)地葡萄樹傷流液20倍左右的濃縮液2mL，于蒸發(fā)皿中減壓干燥，加入1mL醋酐使其溶解，緩慢加入濃硫酸1滴，觀察顏色變化。

2.4 皂苷TLC實驗

2.4.1 展開系統(tǒng) 皂苷：氯仿－冰乙酸－甲醇－水＝60∶32∶12∶8；三萜苷：氯仿－甲醇－水＝64∶50∶10［7］。

2.4.2 點樣量 采用自動點樣法，取2μL進行薄層定性實驗。

2.4.3 顯色系統(tǒng) 本實驗采用茴香醛－硫酸顯色劑進行顯色。配制方法［7］：在冰浴條件下，于85mL甲醇與10mL冰乙酸中，先后加入5mL濃硫酸和0.5 mL茴香醛，即得。薄層板顯色后于105℃加熱5 min，可見光下進行觀察。

2.5 香草醛－冰醋酸法測定皂苷含量

2.5.1 測定波長的確定 分別吸取0.4mL齊墩果酸對照品溶液和20μL喀什木納格葡萄樹傷流液濃縮液于試管中，90℃水浴揮干溶劑，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項下的方法，在200～800nm波長范圍內(nèi)進行波譜掃描，從而確定測定波長。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取齊墩果酸對照品溶液0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.7和0.8mL，置于試管中，90℃水浴揮干溶劑，加入0.5mL·L－1香草醛冰乙酸溶液0.2mL，再加入高氯酸溶液0.8mL，70℃水浴15min，取出，流水冷卻10min，使之反應(yīng)完全。加入4mL乙酸乙酯，搖勻，隨行試劑作空白，于最大吸收波長處測定吸光度［8－11］。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按最小二乘法計算回歸方程。

2.5.3 樣品的測定 精密吸取樣品溶液40μL，置于試管中，揮干溶劑，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項下的方法測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，以齊墩果酸為基準(zhǔn)計算總皂苷的含量。

2.5.4 方法學(xué)考察

2.5.4.1 穩(wěn)定性實驗 精密吸取喀什木納格葡萄樹傷流液濃縮液20μL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項下的方法，每隔10min測定一次吸光度，計算RSD值。

2.5.4.2 重復(fù)性實驗 精密吸取6份喀什木納格葡萄樹傷流液濃縮液20μL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項下的方法測定吸光度，計算RSD值。

2.5.4.3 精密度實驗 精密吸取6份齊墩果酸對照品溶液0.4mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項下的方法測定吸光度，計算RSD值。

2.5.4.4 加樣回收率實驗 分別吸取一定量的喀什木納格葡萄樹傷流液濃縮液，加入適量的齊墩果酸對照品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項下的方法測定吸光度和質(zhì)量，計算其回收率和RSD值。

3 結(jié)果

3.1 皂苷化學(xué)實驗結(jié)果 由泡沫實驗結(jié)果可知，泡沫持續(xù)10min以上，而醋酸－濃硫酸實驗中顏色的變化是黃→紅→紫→藍，說明有皂苷的存在，且可能是三萜皂苷。

3.2 皂苷TLC實驗結(jié)果 由新疆葡萄樹傷流液中皂苷和三萜皂苷的薄層鑒別結(jié)果可知，傷流液中除和田市紅葡萄傷流液和阿圖什木納格葡萄樹傷流液外，均有一定的皂苷和三萜皂苷，需采用其他方法進行定量分析。

3.3 皂苷含量測定結(jié)果

3.3.1 檢測波長的確定 齊墩果酸對照品溶液在548nm處有最大吸收，因此選擇548nm作為測定波長。

3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程的建立 按2.5.2項下方法測定不同質(zhì)量齊墩果酸對照品溶液的吸光度，按最小二乘法計算得回歸方程為：A＝0.008 5C－0.009 9，r＝0.999 9，表明樣品質(zhì)量在0～80.8μg范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

3.4 方法學(xué)考察實驗

3.4.1 穩(wěn)定性實驗 穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明，隨著時間的增加，雖然測定結(jié)果有所上升，但在1h內(nèi)基本穩(wěn)定，其RSD為1.5%，表明該方法穩(wěn)定性好。

3.4.2 重復(fù)性實驗 重復(fù)性實驗的RSD為0.81%，表明該方法重復(fù)性好。

3.4.3 精密度實驗 精密度實驗的RSD為0.83%，表明該方法精密度好。

3.4.4 加樣回收率實驗 結(jié)果見表1。結(jié)果表明，試樣加樣平均回收率為100.2%，RSD為2.6%，可以保證測定結(jié)果的可靠性。

表1 加樣回收率實驗結(jié)果Tab.1 Results of recovery experiment （n＝3）

3.4.5 新疆葡萄樹傷流液皂苷含量的測定 不同品種、不同產(chǎn)地新疆葡萄樹傷流液的皂苷含量見表2。

表2 新疆葡萄樹傷流液的皂苷含量Tab.2 Saponin contents of Xinjiang GBS

由表2可知，不同品種、不同產(chǎn)地新疆葡萄樹傷流液的皂苷含量不同，表現(xiàn)為：吐魯番卡西克傷流液＞喀什木納格傷流液＞和田薩依巴格鄉(xiāng)紅葡萄傷流液＞阿圖什木納格傷流液＞吐魯番馬奶子傷流液＞和田色格孜鄉(xiāng)紅葡萄傷流液＞吐魯番無核白傷流液＞和田木納格傷流液＞和田市紅葡萄傷流液，可見差異較大。

4 討論

在對新疆葡萄樹傷流液進行化學(xué)定性分析和TLC鑒別時，需對樣品進行濃縮才能出現(xiàn)相應(yīng)的顏色和斑點，說明原液中皂苷含量較低。薄層板點樣前需105℃活化30min，層析缸與薄層板需飽和30min，否則容易出現(xiàn)邊緣效應(yīng)和斑點拖尾現(xiàn)象。采用茴香醛－濃硫酸顯色劑進行顯色時，浸染方式相對穩(wěn)定，但浸染時間不能過長，否則斑點會出現(xiàn)溶解現(xiàn)象。

雖然點樣量都是2μL，和田市紅葡萄樹傷流液和阿圖什木納格葡萄樹傷流液在與其他品種葡萄樹傷流液相應(yīng)位置處沒有出現(xiàn)斑點，由此可以說明這2種傷流液中皂苷含量極低，皂苷的確切含量需采用更加準(zhǔn)確的定量方法，如香草醛－冰醋酸法等。

本文采用香草醛－冰醋酸法測定新疆不同產(chǎn)地、不同品種葡萄樹傷流液皂苷含量。吐魯番地區(qū)的3個品種中，卡西克傷流液的皂苷含量明顯高于馬奶子傷流液和無核白傷流液的含量。對其活性穩(wěn)定性探討時，卡西克傷流液的穩(wěn)定性有同樣的趨勢，兩者有無聯(lián)系有待進一步探討；和田地區(qū)3個地方的紅葡萄樹傷流液因為采集地點相距較遠，皂苷含量差異較大；且3個地方的木納格傷流液也有相似的分布情況。由此可以看出，對于新疆葡萄樹傷流液的皂苷含量來說，產(chǎn)地和品種對其都有影響。

本實驗對新疆葡萄樹傷流液的蛋白和皂苷含量［12］分別進行了測定，發(fā)現(xiàn)兩者之間的關(guān)聯(lián)并不大。以喀什木納格傷流液為例，其皂苷含量為75.5 μg·mL－1，僅次于吐魯番卡西克傷流液（106.00 μg·mL－1），而其蛋白含量則最低，為2.96μg·mL－1。這說明新疆葡萄樹傷流液中皂苷含量與蛋白含量不成正相關(guān)關(guān)系。

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Determination of saponin in bleeding sap from Xinjiang grape tree

HUANG Qiong1，2，LIU Ling1，Arkin IBURAIM1﹡（1.Central Laboratory，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China；2.Xinjiang Ailexin Pharmaceutical Limited Company，Urumqi 830011，China）

Objective To determine the contents of saponin in Xinjiang grapevine bleeding sap（GBS）.Methods The qualitative identification was performed by chemical methods and TLC，and the saponin contents were determined by vanillin－perchloric acid assay.Results Xinjiang GBS contained certain amounts of saponin.Turpan Kashyyyk GBS（106.00μg·mL－1）was the highest and Hotan red grape GBS（6.50μg·mL－1）was the lowest.Conclusion Results showed that Xinjiang GBS from different origins and varieties had different saponin contents.

Xinjiang grapevine bleeding sap；saponin；TLC；vanillin－perchloric acid method

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.02.001

R284

A

1004－2407（2015）02－0111－03

2014－09－12）

國家自然科學(xué)基金項目（編號：21162030）

黃瓊，女，在讀碩士研究生

＊通信作者：艾爾肯·依不拉音，男，教授，博士生導(dǎo)師