陳芳園，閔仲生

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京210029;2.江蘇省中醫(yī)院，南京210029)

痤瘡是一種臨床常見好發(fā)于毛囊皮脂腺的慢性炎癥性疾病，各年齡皆可發(fā)病，青少年時(shí)期發(fā)病率最高。近年來由于飲食結(jié)構(gòu)及環(huán)境等改變，發(fā)病率有上升趨勢(shì)，由于病程較長(zhǎng)，嚴(yán)重者可發(fā)展成結(jié)節(jié)、囊腫以及聚合性痤瘡，愈后容易留下痘印凹坑，嚴(yán)重影響美觀，造成患者的心理壓力。三黃瀉心湯出自張仲景《金匱要略》［1］“大黃2兩，黃連1兩，黃芩1兩，以水3升，煮取1升，頓服之”。方中大黃為主藥，黃連、黃芩為輔藥。本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度三黃瀉心湯水提物，觀察在體外對(duì)痤瘡丙酸桿菌生長(zhǎng)的抑制情況。報(bào)告如下。

1 材料

1.1 菌株 痤瘡丙酸桿菌凍干菌株標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC11827，購自廣東省微生物研究所)。

1.2 試藥 注射用乳糖酸紅霉素粉針(購自湖南科倫制藥有限公司，批號(hào):1310202B);三黃瀉心湯(由江蘇省中醫(yī)院藥劑科配置提供)。厭氧指示劑、厭氧產(chǎn)氣袋(選自日本三菱瓦斯株式會(huì)社);瓊脂(L3027，購自美國Sigma-Aldrich公司)。

1.3 儀器 恒溫生化培養(yǎng)箱(選自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司);數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器(常州賽普實(shí)驗(yàn)儀器廠);立式壓力蒸汽滅菌器(選自博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);WGZ-1A濁度計(jì)(上海昕瑞儀表有限公司);BSA224S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器［北京］有限公司);7.0 L厭氧盒(三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社)。

2 方法與結(jié)果

2.1 痤瘡丙酸桿菌的復(fù)蘇以及菌懸液的制備 瓊脂培養(yǎng)基115℃高壓滅菌15 min澆板，作為凍干菌株復(fù)蘇平板。微生物限度室內(nèi)，將全部菌體懸液，移植于瓊脂培養(yǎng)基，平推后置于厭氧培養(yǎng)盒內(nèi)，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，挑取單個(gè)生長(zhǎng)菌落至肉湯培養(yǎng)基。

2.2 菌落計(jì)數(shù) 提取已經(jīng)配備好的菌懸液1 mL，加到9 mL裝有生理鹽水的試管中，就可以得到稀釋10倍的菌液。從稀釋10倍的菌懸液中移取1 mL至9 mL生理鹽水中，從而得到稀釋100倍的菌液。以此類推，依次稀釋，直至得到稀釋1 010倍的菌液，從中各移取0.5，1 mL到平板培養(yǎng)基上，均勻涂布，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，然后對(duì)生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，作出細(xì)菌的生長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。調(diào)整細(xì)菌濃度至106，待用。

2.3 中藥藥液稀釋 采用試管稀釋法。三黃瀉心湯煎劑調(diào)整至相當(dāng)于生藥濃度200 mg/mL，取11支滅菌試管加入營養(yǎng)肉湯1.0 mL，移取三黃瀉心湯煎劑1 mL，加入第1管中，充分混和均勻后取1 mL，加入第2管，以此類推，到第10根試管時(shí)從中取1 mL棄去，最后一根試管中不加任何藥物，只作為培養(yǎng)基對(duì)照組，稀釋濃度和相應(yīng)藥物含量見表1。

表1 三黃瀉心湯水提物藥物稀釋度和相應(yīng)藥物含量

2.4 羅紅霉素藥液稀釋 采用試管稀釋法。將乳糖酸紅霉素調(diào)整濃度至200 mg/mL，取11支滅菌試管加入營養(yǎng)肉湯1.0 mL，將配備好的乳糖酸紅霉素1 mL，加入到第1根試管中，充分混勻混合后取1 mL，再移入第2根試管，以此類推，第10根試管取1 mL棄去，最后一根試管為培養(yǎng)基對(duì)照組，稀釋濃度和相應(yīng)藥物含量見表2。

2.5 藥敏試驗(yàn) 用100 μL定量加樣槍于每管中加入上述新鮮配置菌液100 μL，搖勻，加2～3 mL液體石蠟，置于37℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。

表2 乳糖酸紅霉素藥物稀釋度和相應(yīng)藥物含量

2.6 結(jié)果判定 由于中藥的顏色都較深，所以光是靠肉眼無法判定試管中是否有細(xì)菌生成以及對(duì)藥物的敏感情況。因此在恒溫振蕩器培養(yǎng)48 h后，每管吸取0.5 mL混懸液接種，澆板，置于37℃恒溫、厭氧環(huán)境中培養(yǎng)48 h，將平板放置在無反光，暗色的物體表面上觀察各平板是否有菌落產(chǎn)生，這種方法可以排除中藥顏色深帶來的感染，可以直觀的觀察到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在實(shí)驗(yàn)過程中能夠完全抑制痤瘡皮膚桿菌的生長(zhǎng)的藥物濃度，為對(duì)細(xì)菌的最低抑菌藥物濃度(MIC)，以上實(shí)驗(yàn)步驟重復(fù)3次。

2.7 結(jié)果 空白對(duì)照試管中觀察有菌落生成，在革蘭氏染色鏡檢下可見紫色細(xì)小棒狀或桿狀菌，證明是革蘭氏陽性厭氧菌痤瘡丙酸桿菌，未見其他菌在視野中，沒有被污染［2］。三黃瀉心湯水提和乳糖酸紅霉素對(duì)痤瘡丙酸桿菌的MIC，見表3。結(jié)果表明三黃瀉心湯在濃度低至6.25 mg/mL時(shí)，平板可見痤瘡丙酸桿菌菌落，高于此濃度時(shí)，均未見痤瘡丙酸桿菌菌落，說明三黃瀉心湯及其主要成分大黃、黃芩、黃連對(duì)痤瘡的主要致病菌痤瘡丙酸桿菌有較好的抑制作用，乳糖酸紅霉素培養(yǎng)平板中均未見痤瘡丙酸桿菌的菌落。

表3 三黃瀉心湯和乳糖酸紅霉素對(duì)痤瘡丙酸桿菌的抑制作用

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，痤瘡的發(fā)病機(jī)制主要與皮脂分泌過多、毛周角化過度、痤瘡丙酸桿菌繁殖以及炎癥反應(yīng)四種因素相關(guān)［3］，而毛囊皮脂腺中的痤瘡丙酸桿菌大量繁殖是痤瘡發(fā)病的重要因素［4］。有學(xué)者［5］認(rèn)為痤瘡的嚴(yán)重程度與皮脂腺的分泌量有關(guān)，皮脂分泌過多則痤瘡丙酸桿菌的養(yǎng)料就越多。痤瘡丙酸桿菌(P.acnes)［6］是定居在人體皮膚和黏膜中的正常菌群，屬于小桿菌，它的生長(zhǎng)是通過皮脂中的三酰甘油作為養(yǎng)料，并且皮脂中去脂化的脂肪酸含量與細(xì)菌的數(shù)量成正比。同時(shí)痤瘡丙酸桿菌產(chǎn)生的大量胞外酶，痤瘡丙酸桿菌介導(dǎo)的細(xì)胞免疫這些都增強(qiáng)了痤瘡的炎癥反應(yīng)，是引發(fā)痤瘡炎性反應(yīng)的主要原因［7］。

一般在中重度的痤瘡的治療中，都會(huì)考慮結(jié)合抗生素的治療，而最常用的抗生素有大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類或克林霉素等。紅霉素是大環(huán)內(nèi)酯類代表性抗生素，對(duì)痤瘡丙酸桿菌有很強(qiáng)的抑制作用，但是Eady等［8］研究表明痤瘡患者中痤瘡丙酸桿菌耐藥性的發(fā)生率在逐年上升，紅霉素的耐藥性最為多見，四環(huán)素耐藥其次。有報(bào)道［9］認(rèn)為丙酸桿菌對(duì)紅霉素產(chǎn)生耐藥是因?yàn)榧t霉素A、B、C基因保護(hù)這些新合成的核糖體免受大環(huán)內(nèi)酯類藥物的影響，并且紅霉素還存在交叉耐藥，導(dǎo)致藥物療效更差。

傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為痤瘡的發(fā)病是由肺熱、血熱、風(fēng)熱三要素所引起，而現(xiàn)代醫(yī)家在原來的基礎(chǔ)之上又提出了血瘀、濕熱等新看法［10］。三黃瀉心湯具有瀉火解毒，燥濕泄熱的作用，是治療外科瘡瘍的常用方，瀉火劑中的代表性方劑［11］。大黃、黃連、黃芩泄三焦之火，因此在臨床應(yīng)用中三焦實(shí)火或無形熱邪內(nèi)迫都可用三黃瀉心湯治療，所以有很多醫(yī)家用于治療痤瘡。如喬成林［12］用本方加減治療痤瘡;國內(nèi)研制［13］的純中藥制劑一清膠囊也是原方出自《金匱要略》中的瀉心湯，一清膠囊中大黃、黃連、黃芩相互配伍，常用于治療熱毒血盛之身熱煩躁，目赤口瘡，咽喉、牙齦腫痛，大便秘結(jié)等癥，具有涼血止血、清熱瀉火之功效［14］，還有報(bào)道［15］其臨床應(yīng)用廣泛，除能有效治療痤瘡?fù)?，還用于咽喉炎、丹毒、高血壓、上呼吸道感染等多種疾病。

大黃主要是含蒽醌類衍生物和二蒽酮衍生物［16］，具有顯著抑制巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的功能，大黃中的游離蒽醌對(duì)痤瘡丙酸有很強(qiáng)的抑制作用，同時(shí)還對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、傷寒桿菌等多種細(xì)菌、真菌都有一定的抑制作用［17］;黃芩的主要化學(xué)成分是黃酮類，具有抗菌、消炎、抗氧化、神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)等多種作用，具有廣譜抗菌的活性［18］;黃連含有多種生物堿，最主要的是小檗堿(黃連素)，其次是黃連堿，藥根堿等，抗菌譜廣，對(duì)于多種致病菌都有很好的抑制作用(如金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌、淋球菌及白色念珠菌等真菌)［19］?，F(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究［20-21］發(fā)現(xiàn)，大黃、黃芩等中藥在體外較低濃度時(shí)即能抑制痤瘡丙酸桿菌的生長(zhǎng)，表現(xiàn)出良好的抗菌效果。三黃瀉心湯中3種主要成分是大黃酸、小檗堿、黃芩苷，為實(shí)驗(yàn)采用三黃瀉心湯水提物進(jìn)行痤瘡丙酸桿菌體外抑菌實(shí)驗(yàn)提供了理論依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)以三黃瀉心湯水提物為試藥，乳糖酸紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品為參照物，對(duì)痤瘡丙酸桿菌進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果三黃瀉心湯水提物對(duì)痤瘡丙酸桿菌的MIC是6.25 mg/mL，表明其對(duì)痤瘡丙酸桿菌的生長(zhǎng)有非常好的抑制作用。有研究［22］發(fā)現(xiàn)中藥提取物對(duì)痤瘡丙酸桿菌有明顯抑制和殺菌作用，并且產(chǎn)生耐藥性的可能性極低。三黃瀉心湯作為單純的中藥復(fù)方制劑，對(duì)細(xì)菌不容易產(chǎn)生耐藥性，并且毒副作用更小。此實(shí)驗(yàn)為三黃瀉心湯的進(jìn)一步在臨床上的應(yīng)用提供了科學(xué)的藥效學(xué)理論依據(jù)。

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